副鸡禽杆菌感染PCR诊断及临床药物防治比较试验

文正常 王璇 吴玙彤 吴仙 潘淑惠* 胡伟

（1，贵州省农业科学院畜牧兽医研究所 550005；2，贵州苗疆生态农业开发有限公司 556300）

副鸡禽杆菌（Avibacterium paragallinarum）感染在养鸡生产中俗称鸡传染性鼻炎，主要以甩鼻、鼻窦急性炎性肿胀、急性败血性死亡为主要临床表现。近年来，该病在蛋鸡及肉鸡群中发生频率不断增高，已逐步成为贵州地区危害养鸡生产的一种主要常发性疫病。发病初期，由于特异性临床症状不显著，极易误诊为慢性呼吸道疾病，因用药误差导致病程延误，发病鸡群产蛋率急剧下降和急性死亡，给养鸡场带来较大经济损失。由于近年来养鸡生产上抗生素、磺胺类药物的不规范使用，其耐药性较为明显，如处置方法不当，致使该病在短期内难以得到有效控制且极易复发。同时，因药物对致病菌的抑制作用往往给病原分离鉴定带来一定困难。为此，近年来，我们将PCR 扩增技术用于副鸡禽杆菌感染的诊断，提高了诊断的准确性，给处置方案的制定和疾病控制赢得时间。同时，根据其临床病理特性先后用不同药物处置方案对其防治效果进行评估，筛选出最佳优化防治技术方案，在及时有效控制疫病的同时，也有利于鸡群在短期内生产（生长）性能的恢复。现将其诊断及药物防治临床试验情况给予报道，供同业者借鉴。

1 发病情况及临床病理特性

蛋鸡多发生于50～85日龄育成阶段和产蛋高峰期，肉鸡常见于中大鸡且季节性气温多变时高发。发病早期多呈现“甩鼻”为主的慢性呼吸道症状，个别患鸡鼻孔周边有浆液性渗出，少量凝固呈棕褐色，很难与鸡毒支原体引起的鸡慢性呼吸道病进行临床鉴别；随着发病时间的延长（4～5d），部分患病鸡鼻窦部呈现急性炎性肿胀（图 1、图2），晚间呼吸啰音明显，采食量逐步下降；蛋鸡产蛋量下降明显，畸形蛋显著增多，鸡群呈现急性死亡，鸡冠和鼻窦眶周边组织发绀，重者口腔内有大量灰乳色脓性分泌物渗出；剖检鼻窦腔内见大量灰白色豆渣样炎性分泌物沉积（图3），部分从咽喉到口腔部充满大量灰白色脓性分泌物（图4）；发病中期肺组织呈炎性水肿、充血，肠道炎症变化明显，拉黄绿色混合稀便；肝、脾、肾等主要脏器无显著炎性变化。

2 PCR诊断

2.1 试验材料

2.1.1 试验病料

试验用心脏血液、心包液、鼻窦腔分泌物、鼻窦组织等主要病料采集至疑似患病鸡只。

2.1.2 主要试验试剂

胎牛血清购自浙江天抗生物科技有限公司；GoldView I 型核酸染色剂、Tris、EDTA 等购自宝生物工程（大连）有限公司；胰蛋白大豆琼脂培养基（TSA）、胰蛋白大豆琼肉汤（SAB）、DL2000、2×Taq PCR MasterMix（0.05 U Polymerase/μL）、TIANGEN 血液/细胞/组织基因组 DNA 提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；苯酚、氯仿、无水乙醇等均为国产试剂。

图1

图2

图3

2.2 试验方法

2.2.1 细菌培养分离

采集患鸡心脏血液、心包液、鼻窦腔分泌物、鼻窦组织，在无菌条件下接种于胰蛋白大豆琼肉汤培养基37℃厌氧培养24～36h，待细菌生长后再转培养到胰蛋白大豆琼脂培养基37℃厌氧培养，选择性挑取单个菌落再37℃单独培养，经PCR 扩增检测，收集目标菌冻存。

2.2.2 PCR 引物

参照陈小玲的方法，将副鸡禽杆菌保守片段引物序列由上海捷瑞生物工程有限公司合成，预期基因片段大小为500bp。

上游引物：5′～TGAGGGTAGTCTTGCACGCGAAT～3′；

下游引物：5′～CAAGGTATCGATCGTCTCTCTACT～3′。

2.2.3 基因组提取

分别取分离菌株、眶下窦及鼻腔组织、鼻窦腔炎性分泌物参照TIANGEN 细菌/血液/细胞/组织基因组DNA 提取试剂盒说明书进行，提取的DNA 于-20℃保存。

2.2.4 PCR 扩增

PCR 反应体系 25μL：2×Taq PCR MasterMix12.5μL，上、下游引物各 1μL，DNA 模板 2μL，用双蒸水 补足至 25μL。PCR 反应条件：95℃预变性 10min；95℃变性 45s，56℃退火30s，72℃延伸 1min，30个循环；72℃延伸 10min。PCR 产物于4℃保存。扩增产物的检测：取6μL 扩增产物加入10g/L 琼脂糖凝胶中电泳 25min 左右（电压 90V，电流 40～60mA），然后在凝胶成像仪下观察。

2.2.5 核苷酸序列测定与分析

将PCR 扩增产物送宝生物工程（大连）有限公司进行核苷酸序列测定。

3 不同药物临床防治比较试验

从 2017～2018年，先后用“头孢噻呋钠粉”“10%磺胺间钾氧粉”“孢噻呋钠粉+10%磺胺间钾氧粉+50%卡巴匹啉钙粉”“5%恩偌沙星粉+10%磺胺间钾氧粉+50%卡巴匹啉钙粉”等药物防治技术方案，按照5d 一个药物治疗流程，对48 批次47.1万羽不同日龄段的发病鸡群进行临床应用效果比较，对其治愈情况、复发性、死亡率、用药成本、副反应等指标进行统计分析，综合评估其应用效果，筛选出较为可靠、稳定的临床药物防治方案。

4 试验结果分析

4.1 PCR扩增

经DNA 产物扩增显示，细菌及组织样本均为相近的目的基因扩增条带，其片段大小均为500bp（图5），与预期结果相符。

4.2 核苷酸序列分析

经比对，PCR 扩增产物与GenBank 登录副鸡禽杆菌的基因序列重合率为99%，与预期目标一致（图6），证明扩增片段为副鸡禽杆菌基因片段。

4.3 不同药物方案临床防治应用效果评价

附表中临床药物试验统计共涉及48 批次、47.1 万羽发病鸡群，其结果显示，“头孢噻呋钠粉+10%磺胺间钾氧粉+50%卡巴匹啉钙粉”、“5%恩偌沙星粉+10%磺胺间钾氧粉+50%卡巴匹啉钙粉”两个药物治疗方案，均兼顾了副鸡禽杆菌感染过程中生产鸡群呼吸道炎症及肠道疾病的继发性感染或混合感染情况，其临床治疗效果及稳定性等均优于“头孢噻呋钠粉”和“10%磺胺间钾氧粉”药物治疗方案，可在一个用药周期（5d)内快速、有效控制疫病，有利于鸡群在短期内生产（生长）性能的恢复。蛋鸡的治疗效果优于肉鸡，主要与蛋鸡为舍饲笼养，饲养环境相对稳定，集中用药时饮水充分，均匀度较好，受到外环境干扰因素相对肉鸡较少。

图5 PCR 扩增产物

图6 基因序列比对结果

5 讨论与小结

（1）在养鸡生产中，副鸡禽杆菌感染在发病早期多以“甩鼻”为主要临床表现，其临床观察诊断极易与鸡毒支原体感染导致的鸡“慢性呼吸道”病相混淆，早期误诊和用药方案不当较为常见，因病程延长极易导致疾病快速爆发和患鸡急性死亡。因此，在发病早期必须仔细观察，当用治疗鸡“慢性呼吸道”的药物2～3d 无效或鸡群中部分患鸡出现鼻孔炎性分泌物增加、鼻窦肿胀等特异性症状时，应及时确诊或调整用药方案，避免不必要的经济损失。

（2）头孢噻呋钠粉和磺胺间钾氧粉是养禽生产上的常用药物，也是治疗副鸡禽杆菌感染的首选特异性药物，当副鸡禽杆菌感染鸡群发病后，由于药物使用对病原的抑制性，往往给病原分离鉴定带来一定困难，因此，PCR 快速诊断技术方法的应用能在较短时间内实现副鸡禽杆菌感染的特异性诊断，给治疗药物方案的制定和疾病控制赢得时间，降低了疾病给鸡群带来的经济损失，也有利用鸡群生产（生长）性能的恢复。

附表 发病鸡群临床药物治疗情况统计表

（3）目前，副鸡禽杆菌感染性疫病肉鸡常见于中大鸡且季节性气温骤变时多发，蛋鸡多发生于青年鸡转群分笼或产蛋高峰期，表明生产（生长）应激和季节性气温骤变是其发生的主要诱因。由于多数养鸡农户或养殖场饲养管理经营匮乏，只有当鸡群发生大量死亡时才送检，鸡群已处于疫病发生的中后期，呼吸道、肠道继发感染性疾病明显，由于生产上头孢噻呋钠和磺胺间钾氧药物的长期或大剂量使用，形成了一定的耐药性，在一定程度上限制了药物作用的有效发挥。因此，在制定药物治疗方案时，要充分兼顾对继发感染性疾病的控制。48 批次、47.1 万羽的临床试验病案统计分析表明，“头孢噻呋钠粉+10%磺胺间钾氧粉+50%卡巴匹啉钙粉”、“5%恩偌沙星粉+10%磺胺间钾氧粉+50%卡巴匹啉钙粉”两个药物治疗方案，是目前能在一个用药周期（5d) 内快速、有效控制副鸡禽杆菌感染的优化方案，也有利于鸡群在短期内生产（生长）性能的恢复。同时，在副鸡禽杆菌感染发病期，坚持用消毒剂每天带群消毒，可有效减缓疫病在鸡群中的扩散传播。

（4）应国家对禽蛋产品生产质量安全及兽药使用规范的要求，在制定药物治疗方案时，恩偌沙星禁止在蛋鸡产蛋期使用，对95～135日龄的肉鸡应建立休药期。