甲状腺自身免疫性抗体及甲状腺球蛋白稀释性能分析

唐芳 张波 张立

【摘 要】目的：通过分析甲状腺自身抗体TRAb、TGAb、TPOAb及TG的稀释性能，以探究各项目能否稀释、最佳的稀释液及最适的稀释倍数。 方法：选取核工业四一六医院进行TRAb、TGAb、TPOAb及TG检测的门诊患者血清各20份，浓度超过正常参考值上限但不超过各项目最高检测限;分别检测各项目组的稀释回收率，用相关分析和线性回归进行分析比较。用配对t检验分析TRAb和TGAb不同稀释浓度下的差异。结果：TRAb使用混合阴性血清和通用稀释液的平均回收率分别为（154.6±37.6）%和（126.3±33.2）%，CV分别为25%和27%;TGAb使用不同稀释液时回收率分别为（231.6±182.9）%和（200.8±149.4）%，CV分别为79%和75%;TPOAb稀释后的平均回收率为（238.9±78.3）%，CV为33%;TG的回收率在（100.7±5.2）%，CV为5.3%。TRAb和TGAb不同稀释液稀释所得数据差异有统计学意义（P<0.05）。结论：TRAb可选择1：5进行稀释，所得结果需结合数据模型TRAb（混合阴性血清）期望值=0.740×测定值-0.036进行调整;TGAb和TPOAb在目前实验室条件下不建议稀释;TG可选择1：20的倍数进行稀释。

【关键词】稀释倍数 ;稀释液;TRAb;TGAb;TPOAb;TG;回收率

【中图分类号】R581【文献标识码】A【文章编号】1005-0019（2019）10--01

化学发光免疫分析法将高灵敏的光反应与高特异性的免疫反应结合，其特异性好、灵敏度高，但反应体系明显受温度、湿度、基质效应、反应原理、仪器、试剂性能影响，均有各自的最高检出水平限制。在日常临床工作中，患者某项指标超过最高检出水平时，往往需要对标本进行稀释后重测，以得较准确的检测结果。由于免疫反应定量分析的反应体系受基质效应的影响较明显，因此在选择稀释液及稀释倍数时，需格外谨慎[1]。本文就甲状腺自身免疫性抗体促甲状腺激素受体抗体（Thyrotropin-receptor antibody，TRAb）;抗甲状腺球蛋白抗体（thyroglobulin antibody，TGAb）;甲状腺过氧化物酶抗体（thyroperoxidase antibady，TPOAb）及甲状腺球蛋白（thyroglobulin，TG）的稀释性能进行分析，拟找出该检测项目的最适稀释液和最佳的稀释倍数。

1 资料与方法

1.1 标本来源 随机收集核工业四一六医院2018年5月门诊患者血清标本各20份，标本无黄疸、溶血、脂血。项目参考值范围：TRAb <1.75IU/L;TGAb <115IU/ml;TPOAb<34IU/ml;TG 1.4-78ng/ml。所选标本浓度超过参考值范围上限，低于此项目的最高检测限，如下：TRAb（10 - 40）IU/L，TGAb（900-4000）IU/ml，TPOAb（290-600）IU/ml，TG（100-500）ng/ml。收集到的标本贮存于-20℃冰箱中，待集中分析。

1.2 方法

1.2.1 混合阴性血清制备：收集新鲜血清标本，充分混合后测定TRAb、TGAb水平，要求所测浓度都低于各自的最低检测水平：0.3IU/L和10.00IU/ml[2]。

1.2.2 稀释液及稀释方案选择：（1）TRAb使用罗氏公司提供的通用稀释液和混合阴性血清，分别进行5倍、10倍、20倍及40倍稀释。（2）TGAb使用罗氏公司的通用稀释液和混合阴性血清，分别进行2倍、5倍、10倍及20倍稀释。（3）TPOAb使用罗氏公司的通用稀释液，分别进行5倍、10倍及20倍稀释。（4）TG使用罗氏公司的通用稀释液，进行5倍、10倍及20倍稀释[2]。根据原始血清标本结果和各自稀释倍数计算出各组项目期望值，实际测定结果做为实测值，回收率=实测值/期望值×100%。

1.2.3 检测方法：电化学发光免疫分析法（ECLIA），检测仪器为罗氏电化学发光分析仪cobase601，检测试剂及质控品均来自罗氏公司。

1.2.4 统计学方法：采用SPSS22.0软件进行统计。计量资料用均数±标准差（）表示，各项检测指标稀释后实测值与期望值采用Pearson相关检验和回归分析;TRAb与TGAb在使用不同稀释液后所得结果之间的比较，采用配对t检验进行分析。P<0.05，差异有统计學意义。

2结果

2.1 各项目组回收率比较

根据国家卫计委《临床实验室对商品定量试剂盒分析性能的验证》，回收率在100±15%时为稀释性能可接受范围[3]。从回收率看，仅TG在选用的各个稀释倍数的回收率满足性能验证的要求。2.2 各项目组Pearson相关及回归分析（1）TRAb使用混合阴性血清稀释液和通用稀释液时，R2为0.954和0.876;TGAb使用混合阴性血清稀释液和通用稀释液以及TPOAb稀释时，引起的变异占总变异的比例为0.483、0.573和0.788，建立的回归方程较差。TG的R2为0.998，稀释原因引起变异占总变异的比例分别为0.954和0.998，归入回归方程的变量显著，建立的回归方程好。

（2）各项目根据回归分析建立的模型如下：

混合阴性血清期望值：

TRAb=0.740×测定值-0.036

TGAb=84.01+0.480×测定值

通用稀释液期望值：

TRAb=0.478+0.588×测定值

TGAb=39.90+0.585×测定值

TPOAb=3.817+0.443×测定值

TG =1.046×测定值-0.597

其中， TRAb（通用稀释液）、TGAb两种稀释液条件下及TPOAb各自所获得的模型由于回归平方和数据占总平方和的比例较低，所建线性模型解决不了总的平方和，模型拟合效果较差。TG模型拟合效果好。

2.3 TRAb及TGAb采用混合阴性血清和通用稀释液稀释后各回收率配对t检验分析 结果显示，不论是TRAb还是TGAb，两种稀释液的检测结果均有显著差异（P<0.05）。

3 讨论

甲状腺自身免疫性疫病（autoimmune thyroid disease，AITD）主要包括自身免疫性甲状腺功能减退（autoimmune hypothyroidism，AIH）和Graves病。AITD在男性和女性中的發病率分别为0.2%和2.0%[4]。Graves病在我国人群患病率约为1.2%[5]，约占所有甲亢的85%[6];AIH又分为甲状腺肿型即桥本甲状腺炎（Hashimotos thyroiditis，HT）和非甲状腺肿型即原发性黏液性水肿（Primary myxedema，PM）。TRAb、TGAb、TPOAb是目前临床常用于AITD的实验室检查。TRAb按照功能将其分为刺激型抗体（thyroid stimloating antibody ，TSAb）与抑制型抗体（thyroid blocking antibody ，TBAb）。TSAb主要见于Graves病，它在临床用于Graves病时期诊断、提示复发和判断是否停药中有重要的价值，目前实验室化学发光法仅检测总的TRAb。TGAb是诊断甲状腺自身免疫性疾病的一个特异性指标，在HT患者血清中，TGAb阳性检出率可达90%-95%;TPOAb是HT的诊断标志物，70%以上的甲状腺功能亢进患者、阿托品甲状腺炎和原发性黏膜水肿患者体内均存TPOAb。TG对于因甲状腺肿瘤而接受甲状腺全切的患者术后的转移及复发有一定的提示作用。

本次研究TRAb、TGAb、TPOAb及TG主要用电化学发光免疫分析。由于疾病的检测、治疗、疗效监测的需要，临床医生在日常工作中，常常需要检验科给出一个具体的数据这时，需要对样本进行稀释。由于免疫反应遵循“海德堡曲线”，当对超过线性的样本进行稀释时，因基质效应、操作等引起的误差，将随着稀释倍数的增大，所有的误差也同时放大相应的倍数，误差就会更明显。

本研究中，根据厂家试剂说明书和实际工作所能具备的条件，4个分析项目根据各自不同的需要选用了不同的稀释液和稀释倍数进行检测。TRAb结果相对较好的是做5倍和10倍稀释的结果;在稀释液的选择上，混合阴性血清较通用稀释液好。在使用混合阴性血清进行的检测中，TRAb选着5倍稀释后稀释数据的相关性良好（0.977），实验室根据所建的数据模型，进行反算，得到的结果回收率能满足质量管理的要求。但由于实验数据有限，模型是否能在日常的工作中运用，还需要更多的数据进行验正。

TGAb无论使用混合阴性血清还是通用稀释液，稀释后数据的平均回收率均高，不同水平的回收率变异明显（回收率>200%，SD>100%，CV>70%），各数据间无较明显的规律可循，因而通过实验结果，认为TGAb不宜进行稀释。TGAb本身检测范围较宽，但造成稀释回收率差是否与试剂本身的不稳定因素有关，还需进一步研究。

TPOAb按照厂家试剂说明书的建议，采用的稀释液是通用稀释液，稀释倍数5倍进行操作，试验数据回收率仍然很大（206%-270%，SD=33%），因此，建议是在日常工作中不宜选择稀释操作。

TG稀释后具有很好的回收率（R2=0.998），可以初步判断各水平的回收率符合性能验证的要求[3]。在10倍（厂家建议的稀释倍数）、20倍稀释得到的数据均符合质量评价标准（93.9%-110%）。在日常工作中，选择20倍做为TG的稀释倍数，可以得到更宽的检测范围，所得的结果也是可靠的。

通过本研究，提示因化学发光免疫中抗原抗体反应中干扰物对分析过程的影响，实验室在开展新项目或改良试验方法时，在参考厂家给出的性能参数时，应该对这些性能参数进行验证。其中TPOAb及TGAb试验结果不能满足实验室要求，能否通过降低稀释比例，或通过使用光电子数计算的方式得到结果，因本次实验未涉及，还需进一步验证。

参考文献

刘忠民，高月亭，陈涛.自动生化分析仪自动识别免疫比浊分析中的钩状效应[J].现代临床医学生物工程学杂志，2000，6（4）：252-254.

叶应妩，王毓三，申子瑜.全国临床检验操作规程[M].3版.南京：东南大学出版社.2006：443-444.

临床实验室对商品定量试剂盒分析性能的验证：WST420-2013[S].中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会，2013.

张秀明，黄宪章，曾方银，刘忠民.临床生化检验[M].1版.北京：人民卫生出版社，2012：1382-1384.

陆再英，钟南山.内科学[M].7版.北京：人民卫生出版社，2008：712-721.

中华医学会内分泌分会《中国甲状腺疾病诊断指南》编写组.中国甲状腺疾病诊治指南--甲状腺功能亢进症[J].中华内科杂志，2007，46（10）：876-882.