口蹄疫病毒实时荧光RT-RPA快速检测方法的建立

刘立兵，王金凤，张若曦，石蕊寒，韩庆安，李睿文，王建昌*，袁万哲*

(1.河北省检验检疫科学技术研究院，河北 石家庄 050051；2.河北出入境检验检疫局技术中心，河北 石家庄 050051；3.河北省动物疫病预防控制中心，河北 石家庄 050035；4.河北农业大学动物医学院，河北 保定 071001)

口蹄疫(Foot-and-mouth disease，FMD)是由口蹄疫病毒(FMDV)引起的一种感染家养和野生偶蹄目动物的急性、热性、高度接触传染病，临床症状主要表现为口、舌、鼻镜和蹄冠部出现水泡和溃疡，幼畜出现出血性胃肠炎和心肌炎[1]。FMDV属于小RNA病毒科(Picornaviridae)口蹄疫病毒属(Aphthovirus)，存 在 O、A、C、Asia1、SAT1、SAT2 和SAT3 7个血清型，血清型间无交叉免疫现象[1]。我国主要流行O型和A型，而Asia 1型自2009年后未见临床病例报道[2]。FMDV可以在体内长期存活，感染动物持续排毒，FMD对国内外养殖业造成了严重的经济损失，早期、快速和有效诊断是防控FMD疫情所必须的重要手段[3]。

重组酶聚合酶扩增(Recombinase polymerase amplification，RPA)是一种操作简便、反应快速、特异性强、灵敏性高，并且成本较低的等温扩增诊断技术[4-5]。RPA方法一般在15 min～20 min内完成扩增，并且可以通过琼脂糖凝胶电泳、实时荧光信号检测或侧流层析试纸条(LFS)等不同方式实现对RPA结果的监测。对RPA扩增结果的实时检测一般基于反应体系中的exo探针或nfo探针，以及能够实时监测扩增荧光信号的设备，RPA方法已经被广泛应用于动物疫病病原的快速检测，如猪圆环病毒2型(PCV-2)、猪细小病毒等[6-7]。目前，国外Abd El Wahed等建立了针对FMDV实时荧光RT-RPA方法[8]，但该方法检出限为1.4×103拷贝/μL，灵敏性欠佳；国内杨洋等也建立了针对FMDV实时荧光RT-RPA方法[9]，但该方法依赖于昂贵的设备-安捷伦Mx3005P荧光定量PCR仪，不适用于经济欠发达地区设备较差的实验室，更不适用于野外疫情的现场检测。因此，本研究基于FMDV 3D基因，设计特异性的引物和exo探针，结合便携式具有荧光检测功能的等温扩增仪Genie III，建立了一种快速、可用于现地检测FMDV的实时荧光RT-RPA方法，并使用含不同浓度的灭活FMDV的模拟临床样品进行了验证，以期为FMDV的快速检测提供重要手段。

1 材料与方法

1.1 病毒和临床样品 灭活的血清型O、A、Asia1 FMDV来自商业化口蹄疫液相阻断ELISA试剂盒，购自中国农业科学院兰州兽医研究所。脑心肌炎病毒(EMCV、BD2株)、PCV2(HB-MC1株)及水泡性口炎病毒(VSV)基因组RNA，均保存于本实验室；猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)(JXA1-R株)、猪瘟病毒(CSFV，AV1412株)、伪狂犬病毒(PRV、Barth-K61株)，均购自中国兽医药品监察所。

20份健康猪血清和20份健康牛血清，经OIE推荐的荧光定量RT-PCR方法检测，FMDV均为阴性[10]。将O型FMDV病毒液分别同8份健康猪血清和 8 份健康牛血清，按照 1∶1、1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶100、1∶200 和 1∶400 比例，充分混匀共计200份。24份健康动物血清、16份混合FMDV动物血清和血清型O、A和Asia1 FMDV灭活病毒液作为模拟临床样品使用。

1.2 主要试剂 TwistAmpTMRT exo kit，购自TwistDx公司；病毒DNA/RNA提取试剂盒、DNA纯化回收试剂盒、质粒DNA小量抽提试剂盒、2×TaqPCR MasterMIX，均购自天根生化科技(北京)有限公司；TRIzol试剂、PrimeScriptⅡ1st strand cDNA Synthesis Kit、PreMIX ExTaq、pGEM-T Easy 载体、限制性内切酶NdeⅠ、T7 RNA转录试剂盒，均购自宝生物工程(大连)有限公司。

1.3 引物和探针的设计 在不同血清型的FMDV中，3D基因高度保守，因此将其确定为实时荧光RT-RPA扩增的靶基因。根据NCBI中7种血清型FMDV的参考序列，根据Primer5.0设计扩增3D基因的RT-PCR引物3D-F/3D-R，扩增片段为1 104 bp；根据保守的FMDV 3D基因设计RPA引物(FMDVRPA-F/FMDV-RPA-R)和 exo 探 针(FMDV-RPA-P)，扩增片段大小为258 bp，同时参照文献[10]合成FMDV实时荧光RT-PCR引物和探针(表1)。所有的引物和探针均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

表1 所用引物和探针序列信息Table 1 Sequence of primers and probes

1.4 病毒DNA/RNA提取 根据TRIzol试剂使用说明，提取各亚型FMDV、EMCV、PRRSV和CSFV RNA以及上述200μL健康动物血清、混合血清的总 RNA，并将提取病毒 RNA溶解于 20μL无RNase的ddH2O中；根据病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒说明书提取PRV和PCV2 DNA；使用ND-2000c核酸浓度测定仪(NanoDrop，Wilmington，USA)测定病毒RNA、DNA浓度。所有RNA和DNA均保存于-80℃。

1.5 体外转录FMDV RNA的制备 以O型FMDV病毒基因组RNA作为模板，根据Primescript II 1st strand cDNA Synthesis kit说明书，反转录获得cDNA，以其为模板，以3D-F/3D-R作为引物，PCR扩增FMDV 3D基因。反应体系为50μL：2×TaqPCR MasterMIX 25μL，3D-F(20μmol/L)1μL，3D-R(20μmol/L)1μL,FMDV cDNA 5μL，补水至 50μL。PCR反应条件为：95℃ 5 min；94℃ 30 s、55℃30 s、72℃60 s，32个循环。

PCR产物纯化后克隆至pGEM-T Easy载体构建重组质粒pGEM-T-FMDV-3D，并由上海生工生物工程技术服务有限公司测序鉴定。将阳性重组质粒经限制性内切酶NdeⅠ线性化，并经纯化后及体外转录获得FMDV RNA。利用无RNase的RQ1 DNase对体外转录的FMDV RNA消化，并通过RNA琼脂糖凝胶电泳确定获得体外转录RNA的大小及完整性。使用ND-2000c核酸浓度测定仪测定体外转录RNA的浓度，并通过下列公式计算体外转录RNA的拷贝数：RNA浓度(拷贝/μL)=[RNA浓度(g/μL)×10-9]/(体外转录 RNA 长度×340)×6.02×1023。

1.6 实时荧光RT-RPA方法反应条件的优化 利用TwistAmpTMRT exo kit建立RPA方法，反应体系为50μL：FMDV-RPA-F和FMDV-RPA-R的终浓度分别为 1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L，FMDV-RPA-P的终浓度分别为1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L，FMDV体外转录RNA模板1μL，Buffer A 29.5μL，用ddH2O补足体系。将上述47.5μL体系混匀后加入到装有冻干酶制剂的反应管中，用移液器上下吹打至完全溶解，向反应管中加入2.5μL Buffer B(280 mmol/L醋酸镁)，瞬时离心并涡旋后放入Genie III中40℃反应20min。

1.7 特异性试验 将O型、A型和Asia1型FMDV、VSV、PRRSV、CSFV、 EMCV、 PRV 和PCV2的DNA/RNA按照建立的RT-RPA方法进行扩增，评估该方法的特异性。反应重复5次。

1.8 敏感性试验 将FMDV RNA 10倍倍比稀释(1.0×106拷贝 /μL～1.0×100拷贝 /μL)，取 1 μL 不同浓度的体外转录RNA作为模板，分别进行实时荧光RT-RPA和荧光定量RT-PCR方法[10]扩增，以验证该方法的敏感性。同时，利用上述浓度1.0×106拷贝 /μL～1.0×100拷贝 /μL 的 RNA 作为模板，进行8次独立分析，并采用SPSS软件对检测结果进行Probit回归分析，以确定所建立方法在95%置信区间下的灵敏性。

1.9 重复性试验 选取 1.0×106拷贝 /μL、1.0×104拷贝 /μL、1.0×102拷贝 /μL 3 个浓度梯度的 O 型FMDV体外转录RNA，每个浓度梯度重复3次进行检测，根据起峰时间(TT值)计算组内变异系数；将上述3个浓度进行3个重复，每3 d检测1次，连续检测3次，根据TT值计算组间变异系数，以验证该方法的重复性及稳定性。

1.10 临床样品的检测 应用建立的荧光RT-RPA对16份不同比例O型FMDV混合血清样品、24份健康血清样品和3份FMDV病毒液(O型、A型和Asia1型)的RNA进行检测，同时利用OIE推荐的荧光定量RT-PCR方法[10]进行检测，并比较两种方法的检测结果。

2 结果

2.1 体外转录FMDV RNA的制备 以提取的O型FMDV病毒基因组RNA作为模板，利用3D-F/3D-R为引物进行PCR扩增3D基因，电泳结果显示扩增的目的片段大小与预期一致(图略)。目的片段回收纯化后克隆至pGEM-T Easy载体，构建重组质粒pGEM-T-FMDV-3D，测序结果显示目的片段和3D基因(O型，Cathay株，KF985189)相似性为100%。通过线性化处理、T7转录试剂盒体外转录，获得FMDV RNA，其浓度为63 ng/μL，换算成拷贝数为1.0×1011拷贝 /μL，将其稀释成 1.0×106拷贝 /μL 作为实时荧光RT-RPA反应的标准品。

2.2 实时荧光RT-RPA反应条件的优化结果 通过荧光信号最强，扩增曲线出现最早的引物探针组合为最佳引物探针浓度。当引物为10μmol/L，探针浓度为10μmol/L时，荧光信号最强，曲线出现最早，将其确定为最佳的工作浓度，即实时荧光RT-RPA最佳反应体系为50μL：终浓度为10μmol/L的FMDV-RPA-F和FMDV-RPA-R各2.1μL，10μmol/L FMDV-RPA-P 0.6μL，模板 1μL，Buffer A 29.5μL，ddH2O 10.2μL。将上述47.5μL体系混匀后加入到装有冻干酶制剂的反应管中，用移液器上下吹打至完全溶解，向反应管中加入2.5μL Buffer B(280mmol/L醋酸镁)。

2.3 特异性试验结果 应用建立的实时荧光RT-RPA方法对相关病毒的DNA/RNA进行检测，结果显示，该方法对O型、A型和Asia 1型FMDV均呈现特异性扩增，而对其它常见的猪病病原：VSV、PRRSV、CSFV、EMCV、PRV和PCV2没有任何扩增(图1)。5次试验结果一致，表明所建立的FMDV实时荧光RT-RPA方法具有良好的特异性。

图1 FMDV实时荧光RT-RPA方法的特异性试验Fig.1 Specificity test of the FMDV RT-RPA assay

2.4 敏感性试验结果 对8个浓度梯度(1.0×106拷贝 /μL～1.0×100拷贝 /μL)的 FMDV RNA 进行实时荧光RT-RPA检测，结果显示，本研究建立的方法的检出限为1.0×102拷贝/μL(图 2A)，与荧光定量RT-PCR方法检出限一致(图2A)。Probit回归分析表明，所建立的FMDV实时荧光RT-RPA方法在95%置信区间下的灵敏性为 1.0×102拷贝 /μL(图 2B)。表明本研究建立方法的敏感性为1.0×102拷贝/μL，敏感性较高。

2.5 重复性试验结果 选取3个不同浓度梯度的FMDV RNA进行组内和组间重复性试验，结果显示，组内和组间变异系数均小于1%(表2)，表明建立的实时荧光RT-RPA方法具有良好的重复性及稳定性。

2.6 临床样品的检测 对43份模拟样品分别进行实时荧光RT-RPA和荧光定量RT-PCR检测。结果显示，在16份混合不同比例O型FMDV病毒液的模拟血清中，12份血清(混合比例在 1∶1～1∶100)经两种方法检测均为FMDV RNA阳性；2份混合比例为 1∶200的血清，实时荧光 RT-RPA检测均为FMDV RNA阴性，而在荧光定量RT-PCR检测中均为阳性；2份混合比例为1:400的血清，在两种方法检测中均为FMDV RNA阴性。在灭活的O型、A型和Asia1型FMDV无细胞病毒液中，FMDV RNA在两种检测方法中均为阳性。实时荧光RT-RPA对FMDV RNA的检出率为34.9%(15/43)，略低于荧光定量RT-PCR的检出率(39.5%，17/43)，两种方法的符合率为95.3%(41/43)。但检测时间方面，实时荧光RT-RPA能够在6min～16min内完成样品的检测，而荧光定量RT-PCR则需要30 min～51 min，表明建立的实时荧光RT-RPA方法用于临床样品的检测更快速。

图2 FMDV实时荧光RT-RPA方法的敏感性试验(A)及灵敏性分析(B)Fig.2 Sensitivity of the FMDV RT-RPA

表2 实时荧光RT-RPA的重复性试验结果Table 2 Reproducibility assay of the real-time RT-RPA

3 讨论

一旦发生FMD疫情，将对养殖业造成严重的经济损失。FMD早期、准确的诊断对于该病的有效防控和清除是极其关键的。在临床诊断中，FMD的水泡和溃疡等临床症状，与猪水泡病、水泡性口炎、猪水疱疹和原发性水泡病临床症状极为相似，所以对于FMD的有效控制和清除必须依赖于对FMDV的实验室检测方法。FMDV的传统检测方法，如病毒分离、抗原捕获ELISA等[11-12]，存在费时费力、灵敏性低等缺点，不易在基层广泛开展。目前对FMDV的检测主要依赖于分子检测方法，如RT-PCR、荧光定量RT-PCR。但RT-PCR需要精准昂贵的PCR设备和经过严格培训的技术人员；荧光定量RT-PCR方法在实验室内应用广泛，能够在几小时内给出检测结果，但是该方法需要昂贵的荧光PCR设备，同时临床样品需要在一定的冷链条件下运输到实验室，需要较长的时间，从而造成检测结果的推迟，影响对FMD疫情的有效防控。因此，能够在现地操作的FMDV检测方法，对于FMD疫情的控制极其重要。

本研究通过设计合成FMDV 3D基因灵敏性最佳的引物和探针，提高了实时荧光RT-RPA方法的灵敏性。同时，相比于PCR方法，等温扩增方法不需要昂贵的扩增设备，操作简便快捷，已经在多种动物疫病病原的检测，尤其是现地检测中发挥了重要作用。目前已经建立的FMDV的系列等温检测方法，如反转录绝缘等温PCR、RT-LAMP和解旋酶恒温扩增等，反应时间均在60min～120min[13-16]。

实时荧光RT-RPA引物和探针能够耐受5～9个碱基的突变[15]，而对扩增效果没有影响。本研究以FMDV 3D基因作为靶基因，基于exo探针建立了一种用于FMDV快速检测的实时荧光RT-RPA等温检测方法，能够在40℃20 min内特异性实现对FMDV的检测，且具有较高的灵敏性。组内和组间变异系数小于均1%，表明该方法具有较高的重复性和良好的稳定性。对模拟样品的检测结果表明，该方法能够有效的应用于临床FMDV的快速检测，本研究建立的实时荧光RT-RPA方法能够在6min～16 min内获得结果，实时荧光RT-RPA方法所使用的便携式荧光检测仪-Genie III，仅重1.75 kg，一块充电电池可以维持一整天的工作。这对于欠发达地区的小型、装备较差的实验室，以及在现地开展FMDV检测，具有重要意义，为临床FMDV的检测提供了一种理想的技术手段，能够在FMDV的快速检测中发挥重要作用，从而有效的预防和控制FMD疫情。

本研究建立的FMDV的荧光定量RT-RPA方法，结合便携式具有荧光检测功能的等温扩增仪Genie III，组建了FMDV快速检测平台，能够脱离对大型仪器、专业操作人员及正规实验室的依赖，在基层兽医部门以及现地FMDV检测中具有较大的应用潜力。