山楂原花青素抗氧化、清除亚硝酸盐及阻断亚硝胺合成的研究

宓 伟 韩丽珍 韩富磊 张红萍 蒋 伟 李汶洋 杨灵华 黄续钊 田丽君

1 滨州医学院营养与食品卫生学教研室 烟台 264003；2 临沂市人民医院肿瘤科；3 滨州医学院附属医院肿瘤科

山楂原花青素(hawthorn proanthocyanidins, HPC)是由聚合度不同的表儿茶素及儿茶素组成的混合物，是公认的天然抗氧化剂。研究表明，HPC可清除氧自由基、抑制炎症反应ICAM-1 的表达上调、抗心肌缺血再灌注损伤、抗动脉粥样硬化、保护血管内皮细胞和预防癌症[6]。本实验通过比较HPC与维生素C对自由基和亚硝酸盐的清除能力及对亚硝胺合成的阻断能力，衡量HPC在疾病防治、保健方面的生物学价值，以期为HPC的开发和利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂 山楂原花青素(国西安绿天生物技术有限公司，批号20150402))；维生素C(华南药业集团有限公司，批号 H44020774)；超氧阴离子自由基清除能力试剂盒、羟自由基清除能力试剂盒、总抗氧化能力检测试剂盒(比色法)(美国Sigma公司)；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)(北京诺博莱德科技有限公司)；33%二甲胺水溶液为化学纯；HCl、NaNO2、NaCl、对氨基苯磺酸、α-萘胺、Na2CO3、盐酸萘乙二胺、95%乙醇均为国产分析纯试剂。

1.1.2 主要仪器 紫外-可见分光光度计(日本岛津公司，UV-2700)；TGL-16M高速冷冻离心机(上海赫田科学仪器有限公司)；ALPH2-4真空冷冻干燥仪(德国托普公司)；1 500 W循环过滤超声波清洗机(杭州宝珀超声波科技有限公司)；HHD-1液晶显示电热恒温水浴锅(上海旌派仪器有限公司)；ML-T电子分析天平(梅特勒-托利多国际贸易有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 HPC抗氧化能力测定

1.2.3 HPC对羟自由基(·OH)的清除 采用羟自由基清除能力试剂盒检测HPC对·OH的清除能力：Fenton反应体系中H2O2在Fe2+催化下产生高反应活性的·OH，电子受体存在的情况下，加入Griess 试剂显色，形成红色物质与·OH的含量成正比例关系。具体操作：取底物应用液0.2 mL置于试管中，依次加入不同浓度的样品溶液0.2 mL后加入0.4 mL应用液混匀，37℃反应1 min，立即加入2.0 mL显色剂终止反应；于550 nm下测定A测定管双蒸水代替不同浓度样品，测定A对照管；0.03% H2O2标准应用液代替不同浓度样品，双蒸水代替底物应用液，测定A标准管；双蒸水代替底物应用液和样品溶液测定A空白管。平行测定三次后取平均值计算·OH清除率D：

1.2.4 HPC清除DPPH·自由基的能力 采用体外DPPH法测定HPC清除DPPH·自由基的能力：DPPH无水乙醇溶液呈紫色，浓度与吸光度在517 nm呈线性关系。加入HPC等自由基清除剂后可结合或取代DPPH·，DPPH·浓度降低，吸光度变小，借此可评价HPC对 DPPH·的清除能力。具体操作：取1.0 mL不同质量浓度的样品和维生素C溶液，再分别加入 1.0 mL 0.0178 mmol/L DPPH无水乙醇溶液,避光室温反应20 min，于517 nm条件下测定A对照管，室温避光保存30 min后测A测定管;以无水乙醇溶剂做空白对照，测定A空白管。实验平行测试三次，计DPPH·自由基清除率为K：

1.2.5 HPC总抗氧化能力测定 采用总抗氧化能力测定试剂盒(FRAP法)测定HPC总抗氧化能力：酸性条件下Fe3+—TPTZ可被HPC还原为Fe2+—TPTZ，溶液由橘黄色变为蓝色，于593 nm时有最大吸收光。具体操作：向试剂盒检测管中加入180 μL FRAP工作液，对照管加入5 μL PBS溶液；测定管加入5 μL不同浓度HPC与维生素C样品。37℃ 5 min 于539 nm下测定A对照管和A测定管，平行三次。

1.2.6 HPC清除亚硝酸盐及阻断亚硝胺合成的测定

1.2.6.1 HPC对亚硝酸盐清除能力 采用盐酸萘乙二胺法：酸性条件下亚硝酸根离子与对氨基苯磺酸发生重氮化反应，经盐酸苯乙二胺偶合后生成玫红色产物进行比色测定。具体操作：取不同浓度的HPC与维生素C溶液1.0 mL于试管中，依次加入2.0 mL柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH=3.0)、2.0 mL 0.01 mmol/mL亚硝酸钠溶液混匀。37℃ 1 h后加入2.0 mL 0.4%对氨基苯磺酸混匀，5 min后加入1.0 mL 0.2%盐酸萘乙二胺溶液混匀，538 nm条件下测定A空白管与A测定管。实验平行测试三次，计亚硝酸盐清除率为H：

1.2.6.2 HPC阻断亚硝胺合成能力 采用α-萘胺法：酸性条件下二甲胺与亚硝酸钠生成二甲基亚硝胺，HPC与二甲胺竞争结合亚硝酸钠，从而阻断亚硝胺生成。反应体系中二甲基亚硝胺在紫外光照射下分解为二甲基仲胺和亚硝酸根，亚硝酸根经对氨基苯磺酸重氮化后，再与α-萘胺偶合生成玫红色化合物进行比色测定。具体操作：取不同浓度HPC与维生素C溶液1.0 mL于试管中,依次加入10.0 mL柠檬酸-磷酸二氢钠缓冲液(pH=3.0)、1.0 mL 1.0 mmol/L亚硝酸钠溶液、1.0 mL 1.0 mmol/L二甲胺溶液，充分混匀，37℃ 1 h。吸取1.0 mL溶液于烧杯中，加入0.5 mL 0.5% Na2CO3后于紫外分析仪(245 nm)下照射15 min。取出后依次加入1.5 mL 1%的对氨基苯磺酸、1.5 mL 0.1% α-萘胺、0.5 mL蒸馏水，混匀静置20 min。于525 nm下测定A空白管与A测定管，实验平行测试三次，计亚硝胺阻断能力为J：

2 结果

图1 HPC对超氧阴离子自由基的清除作用

2.2 HPC对羟自由基(·OH)的清除

图2 HPC对羟自由基的清除作用

HPC对·OH清除率较高，随着浓度增大，清除率不断提高(图2)。HPC对清除·OH的EC50为120.5 mg/L。一定范围内，HPC浓度越高对·OH的清除能力越高， 但在290 mg/L其对·OH的清除率的增加幅度较小；当HPC浓度为320 mg/L时，·OH清除率达96.29%。HPC对·OH的清除能力显著高于同浓度的维生素C，HPC能够有效清除·OH。

2.3 HPC清除DPPH·自由基的能力

图3 HPC清除DPPH·自由基的能力

HPC能够有效清除DPPH·自由基(图3)，随着浓度的增大，DPPH·自由基清除率逐渐增加。当HPC浓度达到200 mg/L时，清除率趋于稳定；当浓度为320 mg/L时，DPPH·自由基清除率达97.49%。HPC清除DPPH·自由基的EC50为96.02 mg/L,显著高于维生素C。

2.4 HPC总抗氧化能力测定

图4 HPC总抗氧化能力

HPC的总抗氧化能力显著，抗氧化能力随着浓度的增大而增大(图4)。当HPC浓度为320 mg/L时，总抗氧化能力为21.47 μg/mL。在320 mg/L浓度以下时，HPC总抗氧化能力均显著高于维生素C(P<0.05)。

2.5 HPC清除亚硝酸盐及阻断亚硝胺合成的测定

图5 HPC对亚硝酸盐清除能力

HPC能够清除反应体系中的亚硝酸盐(图5)，浓度在20～80 mg/L范围内清除亚硝酸盐能力较弱；在80～140 mg/L浓度范围内，HPC对亚硝酸盐的清除率增幅明显；在140～320 mg/L时清除率达80%以上，当浓度为320 mg/L时，亚硝酸盐清除率达93.62%。

图6 HPC阻断亚硝胺合成能力

HPC阻断亚硝胺合成能力与浓度成正相关(图6)，随着浓度的增大，亚硝胺合成阻断能力不断提高，HPC浓度为320 mg/L时，亚硝胺合成阻断能力达74.45%。HPC对亚硝胺合成阻断的EC50为171.6 mg/L，但相同浓度条件下HPC阻断亚硝胺合成能力明显低于维生素C。

图7 HPC和维生素C对亚硝酸盐清除活性和

320 mg/L时维生素C对亚硝酸盐清除率和亚硝胺合成阻断能力达到最大，分别为89.07%和89.97%(图7)。100 、290 mg/L时维生素C对亚硝酸盐清除率和亚硝胺合成阻断能力接近，80～260 mg/L范围内亚硝胺合成阻断能力高于亚硝酸盐清除率。与维生素C组比较HPC组对亚硝酸盐清除活性和亚硝胺形成抑制作用不同，80～320 mg/L范围内HPC对亚硝酸盐清除率显著高于亚硝胺合成阻断能力；而20～80 mg/L时亚硝胺合成阻断能力低于亚硝酸盐清除率。

3 讨论

细胞在代谢过程中产生大量氧自由基，这些氧自由基主要结合含不饱和键的生物大分子，对生物膜、核酸和蛋白质造成损伤[7]，引发机体衰老、慢性病、免疫性疾病和肿瘤等病变。HPC由不同数量的儿茶素和表儿茶素缩合而成，总抗氧化能力显著高于维生素C，是清除体内自由基有效的天然抗氧化剂，在清除氧自由基、提高抗氧化能力方面发挥着重要作用[8]。实验中HPC在一定的浓度范围内，其对·OH 的清除率、DPPH·自由基及总抗氧化能力显著高于维生素C，且其清除能力与总抗氧化能力随浓度升高而升高，当浓度为320 mg/L 时，HPC对·OH 的清除率达 96.29%，对DPPH·自由基清除率可达97.49%，总抗氧化能力可达21.47 μg/mL。HPC对不同种类自由基清除率存在明显差异，总抗氧化能力显著高于维生素C，能够有效避免自由基对细胞的损伤。

亚硝酸盐可直接与血红蛋白结合引发高铁血红蛋白症[9]，而且与食物中含氮化合物结合后生成强致癌物亚硝胺。亚硝胺与消化系统肿瘤如肝癌、胃癌和食道癌密切相关[10]，清除亚硝酸盐和阻断亚硝胺的合成对预防癌症有着重要的意义。本实验中HPC能够有效除亚硝酸盐和阻断亚硝胺的合成，HPC浓度升高时其对亚硝酸盐的清除能力随之增大，在HPC浓度为140～320 mg/L 范围内，HPC对亚硝酸盐的清除率均大于维生素C；320 mg/L的HPC对亚硝酸盐的清除率可达93.62%。