中华鳖MyoD1基因SNP鉴定及其与生长性状的关联分析

黄龙 吴本丽 何吉祥 陈静 宋光同 汪翔 张烨 武松

（1. 安徽省农业科学院水产研究所，合肥 230031；2. 水产增养殖安徽省重点实验室，合肥 230031）

中华鳖生长性状受肌肉发育等诸多遗传和环境因素的影响。生长性状的遗传力低，传统杂交改良周期长，寻找控制中华鳖生长性状的主效基因及其遗传标记，使用标记辅助选择加快选育进程，这对提高中华鳖生长性状具有重要意义。研究发现，MSTN基因对中华鳖肌肉生长具有调控作用［1］，随着高通量测序技术的发展，新的生长性状候选基因不断被挖掘，如GRBP2基因和THSP基因［2］。同时，仍然有较多报道从基因功能来推测基因可能影响生长性状，通过扩增多态位点进行关联分析来证明SNP与生长性状的关系，如IGF2基因［3］和GHRL基因［4］。这些研究使得生长性状可利用的标记不断增加。

MyoD1（Myogenic differentiation 1） 是 生 肌 调节因子家族（MRFs）的重要成员，在肌形成早期阶段参与决定肌形成的发生［5-6］。该基因与肌肉基因启动子的特异性区域（E-BOX）相结合后激活肌肉特异性转录，促进肌前体细胞的增殖和分化，可使成纤维细胞及脂肪细胞等转化为成肌细胞，并最终分化为成熟肌纤维［7］。目前，在金头鲷（Sparus aurata）［8］、 鳕（Gadus macrocephalus）［9］、 文 昌 鱼（Branchiostoma belcheri）［10］、 黄 颡 鱼（Pelteobagrus fulvidraco）［11］、 鳜 鱼（Siniperca chuatsi）［12］和 长丝裂腹鱼（Schizothorax dolichonema）［13］等水产动物已完成MyoD基因的克隆、序列分析和表达等研究。鉴于MyoD1基因是影响动物生长性状的重要候选基因，且中华鳖MyoD1基因多态性与生长性状的相关研究尚未见报道，本研究通过直接测序法检测MyoD1基因多态位点，以期获得与中华鳖生长相关的SNP，为中华鳖分子标记辅助选育奠定工作基础。

1 材料与方法

1.1 材料

本实验中华鳖取自安徽省农业科学院水产研究所稻田养鳖基地，随机选择同批繁殖、同块稻田养殖的2冬龄健康中华鳖共178只（其中雄性135只，雌性43只）。测量样本体质量、背甲长、背甲宽、腹甲长、腹甲宽、裙边后侧宽和体高7项生长指标。同时剪取200 mg左右的裙边组织，按照天根生化科技（北京）有限公司试剂盒说明书提取中华鳖组织DNA，使用琼脂糖和紫外分光光度计测定DNA质量和浓度，-20℃保存。2×TaqPCR master mix和DNA分子量标准购自宝生物（大连）工程有限公司；引物委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成；琼脂糖为Sigma公司（美国）产品。

1.2 方法

1.2.1MyoD1基因的扩增及突变位点基因分型 根据NCBI数据库中登录的中华鳖MyoD1基因序列（GenBank登录号：NW_005858157.1）设计4对引物（表1），以中华鳖基因组DNA为模板，采用PCR技术分别扩增MyoD1基因的各个片段。PCR扩增反应总体积为20.0 μL，PCR反应体系包括10.0 μL 2×TaqPCR master mix、上下游引物（20 μmol/L）各 0.5 μL、模板 DNA 0.5 μL，加 dd H2O 至 20.0 μL。PCR反应程序：94℃预变性10 min；94℃变性30 s，55℃退火 30 s，72℃延伸30 s，共进行35个循环；72℃延伸10 min，4℃保存。将PCR产物进行1.2%琼脂糖凝胶电泳检测。PCR产物纯化后送至生工生物工程有限公司测序。测序结果用BioEdit软件进行序列比对分析，获得SNP位点。

表1 中华鳖MyoD1基因扩增引物

1.2.2 构建连锁图谱 利用Haploview软件进行SNP位点间连锁分析。

1.2.3 数据统计分析 利用Picalc程序包计算各位点的多态信息含量（PIC），利用Popgene 32软件计算观测杂合度（Ho）、期望杂合度（He）、有效等位基因数（Ne）和哈温平衡常数。采用SPSS 20软件的GLM程序对MyoD1基因SNP与生长性状的进行关联分析，因变量为中华鳖7项生长指标，自变量为筛选到的突变位点不同基因型。其生物统计模型为：Yij=μ+Gi+Sj+eij，式中，Yij表示某性状第i个标记在第j个个体上的观测值，μ表示试验观测的所有个体平均值，Gi表示第i个标记的基因型效应，Sj表示第i个标记的性别效应，eij表示对应个体观测值的随机残差效应。

2 结果

2.1 MyoD1基因突变位点筛选

通过序列比对，MyoD1基因有6个碱基位置发生突变，其中2个突变发生在启动子区域（T-49G和A-38G），2个突变发生在内含子1（C91T和A187T），1个位点突变发生在外显子2（C880T），还有1个突变发生在外显子2下游区域（T1522A）。其中，C880T位点为错义突变，导致所编码的氨基酸由丙氨酸（A）突变为缬氨酸（V），核酸位置以所参考序列的第一个碱基为参考值1。等位基因频率和基因型频率，见表2。

2.2 MyoD1基因突变位点在中华鳖群体中的遗传结构分析

对178只中华鳖MyoD1基因的6个SNP位点进行分型，统计其遗传参数（表2）。结果表明，多态信息含量（PIC）为0.168 9-0.373 0，期望杂合度（He）为0.186 8-0.497 4，有效等位基因数（Ne）为1.228 9-1.984 0，PIC和He多数处于0.25-0.50之间（除C880T位点），说明多数SNP位点具有中度多态性。经卡方适合性检验，MyoD1基因除A187T 位点外，其余5个位点在中华鳖群体中均处于Hardy-Weinberg平衡状态（P＞0.05）。

2.3 MyoD1基因SNP位点间的连锁分析

利用Haploview软件对中华鳖群体的MyoD1基因的6个SNP位点进行连锁分析，并且构建连锁图谱，结果如图1可以看出，6个SNPs之间r2均没有大于或等于0.8，说明中华鳖群体连锁不紧密，没有形成连锁区块，故按照单标记分析进行突变位点与生长性状的关联分析。

表2 中华鳖MyoD1基因6个SNPs等位基因及基因型频率

表3 中华鳖MyoD1基因SNP位点的遗传多样性参数

图1 中华鳖MyoD1基因6个多态位点连锁不平衡分析

2.4 MyoD1基因突变位点与生长性状的关联分析

采用一般线性模型分析中华鳖MyoD1基因6个多态位点不同基因型与生长性状的相关性（表4）。T-49G位点不同基因型个体间的背甲宽存在显著差异（P＜0.05），突变型（GG）显著大于野生型（TT），为优势基因型；A-38G位点不同基因型个体间的背甲宽存在显著差异（P＜0.05），突变型（AG）显著大于野生型（AA），为优势基因型；A187T位点不同基因型个体间的体高存在显著差异（P＜0.05），突变型（TT）显著大于野生型（AA），为优势基因型；T1522A位点不同基因型个体间的体质量存在显著差异（P＜0.05），突变型（AA）显著大于野生型（TT）和杂合型（TA），为优势基因型。

表4 中华鳖MyoD1基因与生长性状的关联分析

3 讨论

基因组中的SNPs多数位于非编码区域，因受到选择压力较小容易积累变异，而外显子变异率仅为周围序列的1/5［14-16］。本研究中，MyoD1基因在中华鳖群体中共检测到6个SNP位点，其中T-49G和A-38G位点位于基因启动子区域，C91T和A187T位点位于基因内含子1，C880T位于基因外显子2，T1522A位于基因外显子2下游区域。虽然基因非编码区的突变位点不参与氨基酸编码，但会改变基因表达效率进而影响机体的生命活动［17-19］。C880T位点仅存在CC和CT基因型，可能是实验群体经多代选育，人工选择使部分等位基因频率发生改变，需扩大样本群体做进一步研究。

生肌调节因子家族由MyoD、Myf5、MyoG和MrF44个成员组成，在肌肉生成、肌原纤维蛋白合成及肌纤维数量调节等方面起到重要作用，其中，MyoD基因在骨骼肌发育过程起关键的正向调控作用，促进骨骼肌的形成和分化［20-21］。研究表明，MyoD基因突变体会引起斑马鱼胚胎期体节肌肉减少［22］。MyoD基因多态性与生长性能的关联研究在水产动物中报道不多。于凌云等［23］在获取大口黑鲈MyoD基因序列后筛选出7个与生长性状相关联的突变位点；陈松波等［24］在牙鲆MyoD基因内含子1上发现2个SNP对体重、体长和体高等生长性状影响显著；Chen等［25］分析了MyoD1a基因和MyoD1b基因在虹鳟群体的多态性，发现多个突变位点对肉质性状有显著影响；陈静等［26］在草鱼MyoD基因内含子1上发现SNP在体质量、体宽、体高和眼间距等生长性状存在显著差异。

在本研究中MyoD1基因多态性位点与中华鳖生长性状的相关分析结果表明，基因启动子区域T-49G位点的不同基因型在背甲宽存在显著差异（P＜0.05），GG基因型显著大于TT基因型；基因启动子区域A-38G位点的不同基因型在背甲宽存在显著差异（P＜0.05），AG基因型显著大于AA基因型；内含子1 A187T位点的不同基因型在体高存在显著差异（P＜0.05），TT基因型均显著大于AA基因型，体重、背甲长、背甲宽、腹甲长、腹甲宽、裙边后侧宽虽无显著差异，但TT基因型也均大于AA和AT基因型。外显子2下游区域T1522 A位点的不同基因型在体质量存在显著差异（P＜0.05），AA基因型显著大于TT和TA基因型。因此，MyoD1基因可作为研究中华鳖生长性状的候选基因，下一步工作要增加关联的样本数，着重分析T-49G、A-38G、A187T和T1522A位点的影响效用，进一步筛选出中华鳖分子标记辅助选育的有效标记。

4 结论

本研究在中华鳖MyoD1基因上鉴定出6个SNP位 点（T-49G、A-38G、C91T、A187T、C880T和T1522A），其中C880T位于外显子上，属于错义突变。除A187T 位点外，其余5个位点的基因型频率分布均符合Hardy-Weinberg定律。分析各位点与中华鳖生长性状之间的相关性发现，T-49G位点GG基因型个体的背甲宽显著大于TT基因型，A-38G位点AG基因型个体的背甲宽显著大于AA基因型，A187T位点TT基因型个体的体高显著大于AA基因型，T1522A位点AA基因型个体的体质量显著大于TT、TA基因型，其余位点不同基因型个体间的生长性状均不存在显著差异。