我国几种特色果酒专用酵母的研究进展

祖 瑗，钟小祥，李进强，刘晓柱，刘晓辉，黄名正，于志海*

（贵州理工学院 食品药品制造工程学院，贵州 贵阳 550003）

特色果酒是指具有地域特色的非葡萄发酵酒。市场上现有无花果酒、刺梨酒、猕猴桃酒、桑葚酒、蓝莓酒等特色果酒，但市场占有率都很小。特色果酒的小市场除了跟果酒的消费习惯有关外，其中一个很重要的原因就是当前果酒的低品质属性。酵母是果酒酿造的灵魂，是决定果酒品质、口感和风味的重要因素。在当前小市场的特色果酒中，几乎全是采用商业化的葡萄酿酒酵母发酵而来，而未见利用特色果酒专用酵母进行酿制而成。在生态进化过程中，特色水果与自身酵母之间经过了长期的自然选择，是最佳搭档。只有将这些最佳搭档筛选出来，应用于生产中才有可能推动特色果酒产业的优质发展。因此优质酵母菌株的筛选和培育是果酒酿造的核心技术，也是制约特色果酒产业发展的重大科学问题。值得庆幸的是，国内外（特别是国内）同行在特色果酒专用酵母方面的选育工作从未止步，近10年来有不少特色果酒专用酵母的选育报道。本文主要基于国内近10年来的特色专用酵母的选育结果，结合当前市场的生产实际和研究热点，将当前国内同行们的研究结果作一整理，以期为未来特色果酒专用酵母的选育提供参考。

1 浆果果酒专用酵母的筛选与鉴定

浆果是一类多汁肉质单果的统称，由单心皮或多心皮合生雌蕊形成，含一粒至多粒种子。这类果实种类较多（如葡萄、猕猴桃、蓝莓等均属于此类果实），因多汁肉质，适合酿造果酒（如酿酒葡萄）。

与葡萄的农艺性状最接近的浆果当属蓝莓，具有丰富的糖含量和高出汁率、果实大小与酿酒葡萄类似[1]，适宜于果酒酿造。伍鹤等[2]从蓝莓成熟果实、蓝莓叶及蓝莓果园的土壤中筛选到了最优菌株，鉴定为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），该菌株起酵快、发酵能力强、香气浓郁、风味佳。任春光等[3]从蓝莓自然发酵汁中分离到了4株发酵性能较好的酵母菌，这4株菌发酵平稳，酒香和果香配比恰当，酸味适中，蓝莓果酒味浓郁。李丹等[4]从蓝莓自然发酵旺盛期的醪液中分离筛选到了1株粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombeY201505），可产酒精度8%vol。陈小玲[5]从蓝莓的成熟果皮及自然发酵的醪液中分离纯化到73株野生菌株，经逐级筛选，并与安琪商业酵母进行对比，选出1株发酵性能优、乙醇耐受性高、SO2耐受性好的菌株，经26S rDNA D1/D2区序列鉴定及系统发育树分析，确定该菌株为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），同时对该菌株的最佳发酵工艺参数、最佳澄清剂、果酒稳定性等做了较为深入的研究。

桑葚是另一种近年来在专用酵母选育方面研究得较多的果品。当前公开报道的可用来进行桑葚果酒发酵的菌株约6株（见表1）。赵祥杰等[6]以成熟的桑葚果实、桑叶和桑果园土壤为分离源，筛选到了1株优良菌株，该菌株起酵快，能耐高浓度的酒精和SO2，可产生酒精度为11.7%vol的果酒。赵祥杰等[7]从桑椹成熟果实、桑叶以及桑果园的土壤中进行桑椹果酒专用酵母的筛选，得到1株发酵性能优良的酵母菌，该菌株能产生11.7%vol的桑葚果酒。潘训海等[8]以桑葚果汁自然发酵液和桑果园土壤为分离源，分离到了1株优良菌株，该菌株起酵快、发酵过程缓和、产香好，并进行了1 t放大试验，结果显示该菌株可作为桑葚果酒生产酵母。颜雪辉[9]从桑葚的生存环境中分离到了一株发酵性能优良的菌株，该菌株可发酵成酒精度为10.6%vol的桑葚原酒。曹倩雯等[10]以市售桑葚为分离源，从其自然发酵醪液中分离到42株酵母，经过杜氏小管发酵法初筛、产酒精能力复筛和耐SO2和香气活力值三级筛选，最终获得最优菌株，并采用18S rDNA法鉴定为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。孙时光等[11]从桑葚（Fructus mori）的自然发酵醪液中分离到了35株酵母菌，经过三级筛选获得了1株发酵性能优且高级醇产量低的桑葚果酒酵母。该菌株产生高级醇为312.41mg/L，低于安琪商业化的葡萄酒酵母，并且具有较好的乙醇和SO2耐受性，经18S rDNA鉴定为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。

表1 候选浆果专用酵母的发酵性能Table 1 Fermentability of candidate special yeasts for berry

猕猴桃是一类富含维生素C（vitamin C，VC）、维生素E（vitamin E，VE）、维生素K（vitamin K，VK）和类胡萝卜素等营养成分的浆果[12]，一直以来都备受研究者的关注。周元等[13]以猕猴桃皮为原材料分离到2株酵母，其中一株发酵活力强，适合作为猕猴桃果酒发酵的主发酵菌株，而另一株发酵得到的果酒香气独特，香气组分含量高，适合作为猕猴桃果酒发酵的辅助菌株。郝瑶等[14]从猕猴桃中筛选到了1株发酵能力好、果香酒香浓郁的菌株，经26S rDNA鉴定为库德里阿兹威氏毕赤酵母（Pichia kudriavzevii）。蒋成等[15-16]从猕猴桃中获得了2个菌株，均鉴定为毕赤酵母（Pichia pastoris）。

近10年来，还有一些稀有浆果果品的专用酵母筛选报道。如崔铁忠等[17]从柿子果皮及柿果园土壤中筛选出了1株适合柿子果酒酿造的酵母菌。左勇等[18]从无花果（Ficuscarica）的果皮和无花果果酒渣中分离到了41株酵母菌，经过三级筛选最后获得1株起酵快、产酒产香均较好的菌株。谢国芳等[19]从火龙果的自然发酵汁中利用2,3,5-三苯基氯化四氮唑（triphenyltetrazolium chloride，TTC）显色法筛选到了1株优良酵母菌株，该酵母可耐受较高的糖浓度、SO2浓度和酒精度，可产生具有火龙果典型风味的果酒。周兴伟[20]对树莓专用酵母进行了分离研究，从树莓中分离到了1株SO2耐受力好，产酒率高的优势酵母菌，但是与英联马利阿城酵母菌公司的酵母菌株相比，性能还不够优越。

2 梨果果酒专用酵母的筛选与鉴定

梨果是由合生心皮下位子房与花托、萼筒共同发育而成的肉质果，属假果。苹果、梨、山楂、枇杷等属于该类果实。梨虽然没有特殊的果香，但是其较高的出汁率和糖含量仍吸引了不少研究者的眼球。近年来有不少从梨果中筛选专用酵母的报道，从梨中分离到的酵母约有6株（见表2）。曹新志等[21]从梨的自然发酵液中分离到1个酵母菌株，该菌株在梨汁中发酵力强，产酒度较高，残糖较低，产香较好，完全可作独立的发酵菌株使用。陈文学等[22]从腰果梨和果树根部土壤中分离得到65株酵母菌，经过筛选，最终确定一株最优菌株，该菌株能耐300 mg/L的SO2。金磊[23]以梨的果皮和梨园土壤为分离源，分离到了2株特征酵母，包括发酵性能优良的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和产香性能突出的东方伊莎酵母（Issatchenkia orientalis），并且以这两株酵母为出发菌株，进行原生质体融合育种，最终获得1个优良融合子DJ02，该菌株具有发酵能力强、产香能力好的双亲优点，为适合酿造梨酒的酵母菌株。刘根娣等[24]以冬果梨为富集培养基，从980株野生酵母中筛选分离到1株发酵性能优良的菌株，经26S rDNA D1/D2序列分析法鉴定为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。王东玉[25]从海棠果（Calophyllum inophyllum）中分离到了4株酵母，经5.8S-ITS区的PCR/RFLP分析分别鉴定为葡萄汁有孢汉逊酵母（Hanseniaspora uvarum）、克鲁维毕赤酵母（Pichia kluyveri）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和路德类酵母（Saccharomycodes ludwigii）。其中菌株B20具有高耐受性和发酵性能，可作为海棠果的发酵专用酵母。石明杨[26]从沙果（Malus asiatica）的表面及发酵汁中分离到了1株优良菌株，经26S rDNA D1/D2区的PCR/RFLP分析，鉴定为毕赤酵母（Pichia pastoris）。

表2 候选梨果专用酵母的发酵性能Table 2 Fermentability of candidate special yeasts for pome

3 核果果酒专用酵母的筛选与鉴定

核果是由单心皮雌蕊、上位子房形成的果实，亦有由合生心皮雌蕊或下位子房形成。桃、杏、胡桃等属于该类果实。杨梅是近年来分离到的酵母较多的核果。杜晶等[28]从杨梅果园周边环境及杨梅发酵醪中筛选到了4个菌株，这些菌株在产气性能、色泽和风味方面都比较突出（见表3）。李艳等[29]从青梅（Vatica mangachapoi）中筛选到1株优良菌株，该菌株能够产生酒精度为11.9%vol的青梅果酒，但是其整个酒产品的性能不及葡萄酒酵母BV818，因此该菌株仅仅是一株具有改造潜能的青梅果酒酵母。张陈云等[30]从冬枣发酵液中筛选的酿酒酵母TN9#为出发菌，进行了紫外诱变育种研究，最终获得一株优良的冬枣果酒专用菌株，该菌株能产生12.8%vol的果酒，并且能耐18%vol的酒精度。蒋锡龙等[31]从成熟桃表面选育到了1株产酒产香能力达到酿酒生产要求的菌株，经26S rDNA分子生物学手段鉴定为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。石明杨[26]从桃的表面及发酵汁中分离到了1株优良菌株，经26S rDNA D1/D2区的PCR/RFLP分析，鉴定为葡萄汁有孢汉逊酵母（Hanseniaspora uvarum）。岑涛等[32]通过对从芒果果皮上分离到的6株酵母菌的分析发现，DTM9最适合于芒果果酒的酿造，经26S rDNA序列鉴定为海洋嗜杀酵母（Wickerhamomyces anomalus）。许程等[33]从樱桃果园的土壤中筛选到了1株发酵性能优良的酵母，能耐250 mg/L的SO2，并能保留樱桃酒的特征风味，经18S rDNA鉴定为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。李凯等[34]从樱桃中筛选到了1株适合于红心火龙果发酵的专用酵母，经18S rDNA序列鉴定为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。

表3 候选核果专用酵母的发酵性能Table 3 Fermentability of candidate special yeasts for drupe

4 柑果果酒专用酵母的筛选与鉴定

柑果属单果，特指芸香科柑桔属的果实类型。如橙、桔、柚等属于该类果实。因这类果实含糖量较高，特征风味明显，近年来有一些关于该类果实酿造果酒，并从柑桔类果实上筛选专用酵母的研究报道。游见明[35]从腐烂桔子中分离得到35株酿酒酵母，从中筛选出3株发酵性能较优良的菌株。编号为F16的菌株在发酵性能及桔子酒的品质方面，总体表现最优，可作为桔子酒发酵用菌种或桔子酒专用菌种选育的出发菌株。潘训海等[36]以脐橙果汁自然发酵液和果园土壤为分离源，分离到了1株优良酵母，该菌株起酵快、发酵过程缓和、产香好，可作为脐橙果酒发酵用酵母。王雪莹等[37-38]从土壤、甜橙果实表面共分离到138株酵母菌，经四级筛选后获得了发酵性能优良的2株酵母，均鉴定为葡萄汁有孢汉逊酵母（Hanseniaspora uvarum）。贾瑞楠等[39]从橙汁发酵液中分离到了1株能产11.75%酒精的优良菌株，该菌株能耐250 mg/L的SO2，经18S rDNA鉴定为酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）。张大为等[40]从柑橘自然发酵液中分离到1株产酒精能力和产香能力均较强的菌株，经26SrDNAD1/D2区序列鉴定为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。陈清婵等[41]比较分析了商业酵母FX10、安琪果酒酵母、高温酿酒酵母和2株前期从柑橘中分离到的菌株JZ-1、JZ-2对柑橘果酒香气成分的影响，结果发现JZ-2生香效果最好，安琪果酒酵母发酵橘子酒的香气最丰富。

表4 候选柑果专用酵母的发酵性能Table 4 Fermentability of candidate special yeasts for citrus fruit

5 其他类果实专用酵母的筛选与鉴定

菠萝是一类聚花果，具有独特的风味，近年来亦有在该类果实上分离专用酵母的报道。胡月英等[42]从成熟的菠萝表皮和果肉分离得到101株酵母菌，经过筛选，最终选到一株最优菌株，该菌株在SO2质量浓度为300mg/L、pH1.5、乙醇含量为19%时，均能产气发酵。且对菠萝汁的发酵能力强，菠萝酒香气浓郁。匡钰等[43-44]从菠萝中筛选到了1株酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），由于该菌株耐SO2能力仅为60 mg/L，经原生质体紫外诱变育种后获得1株性能较好的菌株H10-15，并进行了活性干酵母的研究。

表5 候选其他类果实专用酵母的发酵性能Table 5 Fermentability of candidate special yeasts for other fruits

6 结论与展望

特色果酒专用酵母的筛选、鉴定与培育是果酒产业发展中的核心问题。我国幅员辽阔，有很多特色水果，为特色果酒的酿造提供了丰富的原料。当前研究的特色水果种类较多，涉及浆果、梨果、核果、柑果等，几乎含糖量较高的水果均有相关专用酵母分离的研究，研究程序一般遵循“三步筛选法”即TTC初选-发酵能力（杜氏管）复筛-菌株发酵试验（三级筛选）即可筛选到具有一定功能的目标菌株，但是对于筛选到的菌株的生理生化性质、表观性质等方面较全的研究极少见，影响果酒生产的核心信息如乙醇产量、SO2耐受性、乙醇耐受性等没有完全刻画（见表1～表5）。在微生物鉴定方面，单凭ITS、18S rDNA、26S rDNA等常规方法就可以鉴定到种的水平，作者认为证据是不充分的，要做得更充分准确，可能还得有扫描电镜和比较基因组学证据（或不同看家基因序列的交互验证）。另外，菌株研究的延续性欠佳。大部分菌株在发表后很难见到后续研究报道，本来很多文章所发表的菌株均有很好的发酵性能，但是由于其后续的基础研究缺乏延续性，导致该菌株很难走到商业化这一步，这可能是当前国内所筛选的酵母商业化率低的重要原因。虽然特色水果的专用酵母与水果本身是经历了长期的自然选择而形成最佳配合关系，但是自然来源的菌种资源往往存在一定的缺陷，如乙醇产量不高、耐SO2性能欠佳、凝集性弱、高级醇产量高等问题，只要有相应水果来源的菌株，其相关性状均可通过基因工程等手段解决，而当前研究在这方面投入精力做精细工作的很少。

实际上，在同一种水果的不同发育时期的微生物群落是有差异的。因此要想获得性状较佳的微生物资源，需要对水果上的菌种进行立体式的筛选，在不同发育时期、不同小气候环境等条件下进行取样，从其生长的土壤环境、果实发酵液中等进行取样分析。当前的酵母分离中酒精的生产量不应该是唯一目标，产香、降酸、凝集性好等这些来源于非酿酒酵母的性状也应该是科研人员的关注点，因为这些非酿酒酵母的专属性跟酿酒酵母一样，依然能够影响果酒的风味和口感[45]。