LDL与Raw264.7细胞中肾素-血管紧张素系统表达

刘南 章程 武舒佳 武军驻(通讯作者)

（武汉大学基础医学院生物化学及分子生物学系 湖北 武汉 430071）

动脉粥样硬化（Atherosclerosis，AS）是心血管系统中最常见的，威胁我国人民健康的慢性疾病[1]，在发达国家其发病率和死亡率也很高[2]。AS是受损动脉的病变是从内膜开始的。LDL参与了AS的病变过程，LDL的氧化在慢性炎症反应中起着极其重要的作用[3-5]。血管紧张素（Angiotensin，Ang)是肾素-血管紧张素系统（RAS）中的多肽，可使血管收缩，进而导致血压升高。至今为止，4种血管紧张素肽（AngI、AngII、AngIII和AngIV)和四种血管紧张素受体(AT1、AT2、AT3和AT4)已经被鉴定[6]。无活性的AngI通过血管紧张素转换酶（ACE）转化为AngII。AngII代谢为AngIII，而后通过两种氨肽酶转化为AngIV。AngII和AngIII是AT1和AT2受体的完全激动剂。AngII是最有效的效应因子，通过调节血容量，血压，外周血管张力，在维持心血管系统的稳态中起重要作用[7-8]。但AngⅡ与LDL氧化之间的相互作用关系尚不清楚，本研究旨在探究LDL氧化过程中对肾素-血管紧张素系统的影响，为研究AngⅡ与LDL氧化之间的相互作用关系提供一定的依据。

1.材料与方法

1.1 主要试剂

实验室保存有Raw264.7巨噬细胞，LDL购自ProSpec-Tany公司。AT2R抗体来源于Abcam公司，GAPDH抗体来源于美国EarthOx公司。小鼠血管紧张素转化酶（ACE）试剂盒、小鼠血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）试剂盒购自上海仁捷生物科技有限公司。

1.2 细胞培养

小鼠RAW264.7细胞培养在含1%青霉素-链霉素，10%胎牛血清，90%DMEM的完全培养基中，置于5% CO2，90% 湿度，37℃的恒温培养箱中培养。

1.3 LDL处理

Raw264.7细胞达到80%-90%细胞密度时，换成无血清和双抗的DMEM培养基中同步化过夜，加入LDL（终浓度100μg/ml,含终浓度1μM的Cu2+），在培养箱中孵育不同的时间。用RIPA裂解液裂解细胞，离心取上清。

1.4 小鼠血管紧张素转化酶（ACE）试剂盒测定

ACE的活性 收集LDL刺激的细胞裂解后的上清，设置标准品孔和样本孔，分别加入对应的标准品和样品，空白孔不加；每孔加入检测抗体-HRP，空白孔除外；37℃孵育60min。洗涤液清洗5遍，每孔加入底物A和B，37℃避光孵育15min。每孔加入终止液，15min 内，在450nm 波长处测OD值。以测得标准品的OD值和浓度值绘制标准曲线，得到直线回归方程，将ACE的OD值代入方程，计算出ACE的活性。

1.5 小鼠血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）试剂盒测定AngⅡ的表达

收集LDL刺激的细胞裂解后的上清，设置标准品孔和样本孔，分别加入对应的标准品和样品，空白孔不加；每孔加入检测抗体-HRP，空白孔除外；37℃孵育60min。洗涤液清洗5遍，每孔加入底物A和B，37℃避光孵育15min。每孔加入终止液，15min 内，在450nm 波长处测OD值。以测得标准品的OD值和浓度值绘制标准曲线，得到直线回归方程，将AngⅡ的OD值代入方程，计算出AngⅡ的含量。

1.6 Real-Time PCR检测ACE mRNA的表达

提取细胞总RNA，设计β-actin上游引物为5'-CTCCATCCTGGCCTCACTGT-3'；下游引物为5'-GCTGTCGCCTTCACCGTTCC-3'， 设 计ACE上 游引物为5'-TACAACTCCAGCGCCGAAC-3',下游引物为5'-GCCAGATCGGTTCATACAGC-3'；逆转录42℃ 2min，37℃ 15min，85℃ 5sec。随后上机进行Real-Time PCR检测。结果处理：相对定量 2–ΔΔCt法。ΔCt（对照组）= Ct（对照组目的基因）- Ct（对照组内参基因），ΔCt（实验组）= Ct（实验组目的基因）-Ct（实验组内参基因），ΔΔCt=ΔCt（实验组）-ΔCt（对照组）。

1.7 Real-Time PCR检测

AT2R mRNA的表达 提取细胞总RNA，β-actin引物同上；设计AT2R上游引物为5'-ACAGGATAACCCGTGACCAAG-3'，下游引物为5'-ACACTGCGGAGCTTCTGTTG-3'；逆转录42℃ 2min，37℃15min，85℃ 5sec。随后上机进行Real-Time PCR检测。结果处理：相对定量 2–ΔΔCt法。

1.8 Western Blot检测AT2R的表达

将LDL刺激细胞后的裂解上清进行SDS-PAGE，180mA横流转膜2h，脱脂牛奶封闭2h，一抗4℃摇床孵育过夜。TBST洗涤3次，每次15min。二抗室温孵育2h后，TBST洗涤3次，每次10min。加ECL显影，随后用软件扫描灰度值分析条带。

1.9 统计学分析

用SPSS软件分析数据，计量资料用均数±标准差表示，运用Graphpad Prism5作图，用t检验P＜0.05为差异有统计学意义。

2.结果

2.1 LDL刺激使ACE活性升高

LDL处理Raw264.7 0、5、10、15min，用ACE试剂盒测定ACE的活性变化：与对照组相比，酶的活性在刺激后5min（1.3667±0.1457，P＜0.05）、15min（1.3767±0.1401，P＜0.05）增高（图1）。

图1.LDL刺激Raw264.7细胞0、5、10、15min后ACE的活性变化n＞3,*P＜0.05

2.2 LDL刺激使AngⅡ表达升高

LDL处理Raw264.7 0、1、3、5、7、9、12h，试剂盒测定AngⅡ的表达：与对照组（797.6±12.46），相比，刺激后AngⅡ1h（952.5±21.28，P＜0.05）、7h（969.63±20.82，P＜0.05）表达升高（图2）。

图2 LDL刺激细胞0、1、3、5、7、9、12h后AngⅡ的表达变化n＞3,*P＜0.05

2.3 LDL刺激Raw264.7细胞后检测ACE mRNA的表达

LDL处理Raw264.7细胞0、1、3、5h：与对照组相比，刺激后3h ACE mRNA的表达升高（1.2533±0.1405，P＜0.05）,5h下降（0.7000±0.1100，P＜0.05）（图3）。

图3.LDL刺激细胞0、1、3、5h后ACE mRNA的表达变化n＞3,*P＜0.05

2.4 LDL刺激Raw264.7细胞后检测AT2R mRNA的表达

LDL刺激Raw264.7细胞0、1、3、5h：与对照组相比，刺激1h（2.805±1.006，P＜0.05）、5h（3.6700±1.0934，P＜0.05）后AT2 mRNA表达升高（图4）。

图4.LDL刺激细胞0、1、3、5h后AT2RmRNA的表达变化n＞3,*P＜0.05

2.5 Western Blot检测AT2R的表达

LDL刺激Raw264.7细胞0、1、3、5h后，检测AT2R的表达：AT2R蛋白表达升高，3h（2.5967±0.7253，P＜0.05）、5h（2.5933±0.6886，P＜0.05）升高约2.6倍（图5）。

图5.LDL刺激细胞0、1、3、5h后AT2R的表达变化n＞3,*P＜0.05

3.讨论

研究表明，AngⅡ参与了AS的病理生理过程，血管紧张素II诱导的高血压会加重ApoE-小鼠中AS的发展[9]。LDL的氧化过程是一个多因子参与的过程，早期的研究已经表明人体注射血管紧张素Ⅱ（AngiotensinⅡ，AngⅡ）后血压的升高与血清 LDL 水平密切相关。近期研究发现AngⅡ会促进LDL聚集[10]。因此AngⅡ和LDL之间应该存在相互作用。

在本实验中，在LDL刺激5-15min内ACE的活性提高，从而使AngⅡ的含量在1h后也升高，因此LDL可以促进AngⅡ的表达；并且ACE mRNA、AT2 mRNA与蛋白表达都升高，说明LDL能激活RAS。因此天然LDL粘附于细胞被氧化成oLDL的过程中，血管紧张素转移酶（ACE）被激活，使AngⅡ表达升高，进一步LDL促进了ACE mRNA和AT2受体的表达，说明LDL激活了肾素-血管紧张素系统。

我们推测天然LDL氧化过程中，AngⅡ可能作为识别标签，通过识别受体AT1、AT2，介导细胞对LDL的氧化。本实验可作为AngⅡ与LDL相互作用的部分依据，后面会继续研究AngⅡ作用于LDL的方式，检测AngⅡ与LDL的相互作用方式，探究LDL氧化的分子机制。