纳米银对铜绿假单胞菌及希瓦氏菌的抗性实验

刘奇杰

摘 要：目的：研究纳米银和对特定菌种的抗菌性能，阐述了纳米银和纳米纤维抗菌作用效果。方法：（1）微生物培养实验，采用琼脂培养基，在生化培养箱内培养18-24h，然后在显微镜下观察微生物的菌落形貌及特点;（2）抗菌实验，主要采用纳米银对铜绿假单胞菌和希瓦氏菌分别作用，研究纳米银存在的情况下，琼脂培养基上铜绿假单胞菌的生长情况，同时通过显微镜观察细菌的破损情况。结果：浓度越高的纳米银溶液所得抑菌环直径越大，与纳米纤维相比抑菌效果更好。结论：纳米银对于铜绿假单胞菌和希瓦氏菌都具有较强的抑制作用。

关键词：纳米银;细菌培养;抗菌实验

中图分类号：Q2-33 文献标识码：A 文章编号：1671-2064（2019）06-0246-02

0 引言

近年来，由细菌和病毒感染引起的发病率和死亡率普遍增加，患者只能采取强化治疗，包括使用广谱抗生素或药物。寻找新型抗菌物成为新时代的新问题。铜绿假单胞菌是医院感染的常见病原体，属于革兰氏阴性非发酵杆菌。在球杆或线的形状中没有固定的形状，并且有时它成对或短链排列。在细胞的一端存在单个鞭毛，并且在暗视野显微镜或相差显微镜下观察细菌的移动。生长温度范围25-42℃，最适生长温度为25-30℃。[1]由于铜绿假单胞菌属于伤口部位常见感染细菌，广泛存在于环境以及正常人的呼吸道等处，该菌株具有多种天然和获得性多药耐药机制。[2]希瓦氏菌（Shewanella）是一种革兰氏阴性细菌，兼性厌氧，具单一极生鞭毛，DNA的G+C含量为43～55mol%， Baumann等人于1972年将其归至交替单胞菌属（Al- teromonas）。希瓦氏菌是人和水产动物的潜在病原，主要是腐败功能，给人类健康和水产养殖造成威胁。因此研究如何杀灭这两种细菌，具有重要意义。

银离子的杀菌作用自古以来就是众所周知的。而银离子的化学性质不稳定，影响其在抗菌中的应用。有效的抗菌性能导致所用银量的显著减少，这保证了纳米银作为抗菌剂的成本和安全性。[3]试用纳米银作为假单胞菌和希瓦氏菌的抗菌物，为纳米银可促进人类健康生活提供依据。

1 材料与设备

1.1 材料

琼脂粉：SIGMA;滤纸：HEPA。

1.2 设备

生化培养箱;生物安全柜：BIOBASE BSC-1500IIA2-X;显微镜：MOTIC DMBA210;扫描电子显微镜：TESCAN;电子秤：METTLLER TOLEDO AB104-N;高压灭菌锅：BOXUN。

2 实验方法

2.1 培养基的制备

配置培养基供细菌生存，十组培养基大约所需1000毫升的水和28克的琼脂粉。使用电子秤称量28g琼脂粉，用量筒量取1000ml水，将二者在锥形瓶中混合并用电磁搅拌机搅拌均匀。将制好的溶液放入高压灭菌锅灭菌，等其达到121度时关闭蒸汽阀，等待温度下降后，取出溶液。将溶液倒入备好的培养皿中（该过程在生物安全柜中进行），待琼脂冷却凝固。

2.2 微生物培养实验

采用琼脂培养基，在生化培养箱内培养18-24h后在培养基表面蘸取一些菌群浸入溶液中，将希瓦氏菌和铜绿假单胞菌的溶液稀释，分别用滴管取一滴置于已备好的载玻片上，盖上盖玻片，然后在光学显微镜下观察微生物的菌落形貌及特点。

2.3 纳米银对希瓦氏菌的抗性研究

取5μl（10000 CUF/ml）已稀释的希瓦氏菌液均匀涂抹到备好的琼脂培养基上。将接种好的培养基至于生物安全柜中保存。再在接種好的培养皿上放置剪好的滤纸圆片（10-20mm），取三种不同浓度0.5*107particles/ml、1.5* 107particles/ml、2.0*107particles/ml的纳米银溶液各2μl分别滴到三个滤纸圆片上，这三组与未滴加纳米银的对照组一同放入生化培养箱内培养，控制温度在33度左右大约24h后观察实验结果。

2.4 纳米银对铜绿假单胞菌的抗性研究

取5μl（10000 CUF/ml）已稀释的铜绿假单胞菌接种在琼脂培养基上至于生物安全柜中保存。再接种好的培养皿上放置剪好的滤纸圆片（直径10-20mm），取三种不同浓度0.5*107particles/ml、1.5*107particles/ml、2.0*107particles/ml的纳米银溶液各3μl分别滴加在三个滤纸圆片上，这三组与未滴加纳米银的对照组一同放入生化培养箱内培养，控制温度在33度左右大约24h后观察实验结果。

2.5 比较纳米银与纳米纤维对希瓦氏菌的抗菌效果

取同等大小的纳米纤维与纳米银置于同一已接种好希瓦氏菌的培养基上，将该培养皿至于生化培养箱内控制一定温度，进行细菌培养。24小时后取出观察希瓦氏菌在培养皿上两种抑菌环的大小。

3 结果与讨论

3.1 纳米银对于对希瓦氏菌的抗性研究结果

如图1和表1所示，浓度分别为0、0.5*107、1.5*107、2.0* 107particles/ml的纳米银溶液培养的锡瓦氏菌的培养基上出现的抑菌环从无到有，并且直径随浓度增大而增大。说明纳米银其浓度越高对希瓦氏菌的抗性越强。

3.2 纳米银对于假单胞菌的抗性研究结果

如图2和表2所示，浓度分别为0、0.5*107、1.5*107、2.0* 107particles/ml 的纳米银溶液培养的假单胞菌的培养基上出现的抑菌环从无到有，并且直径随浓度增大而增大。说明纳米银其浓度越高对假单胞菌的抗性越强。

3.3 比较纳米银与纳米纤维对希瓦氏菌的抗菌效果结果

如表3实验可观察到纳米银产生抑菌环（直径为2.6cm）比纳米纤维产生抑菌环（直径为1.7cm）大，由此可见纳米银比纳米纤维的抗菌效果更明显，那是什么导致纳米纤维具有纳米银同样的抗菌性但却没有同样的抗菌效果呢？

Ag具有基本抗菌作用，通过图3TiO2/Ag纳米纤维的EDX可分析出Ag元素在纳米纤维内占比不高，所以其抗菌效果不如纯纳米银材料的抗菌效果。

通过图4透射电镜图可观察到Ag在纤维上的分布在纤维中部较稀疏在纤维边缘有小的集中因其元素浓度较低导致抗菌效果不如纳米银抗菌效果明显。

即Ag元素的浓度越高对菌种的抗性越强，对于Ag元素分布不均的纳米纤维来说应从局部的效果考虑。

3.4 抗菌机理分析

纳米级二氧化钛具有抗菌、自洁净功能，同时纳米银带正电荷，与带有负电荷的菌体蛋白质之间产生静电吸引，从而吸附在菌体细胞膜上。纳米银与细胞壁之间发生化学作用并破坏细胞壁的完整性，在细胞壁富集电子部位表现更为明显，导致细胞壁正常功能丧失，如营养渗透等。以大肠杆菌为对象，研究纳米银的抗菌作用，用电子显微镜观察看到，纳米银作用后的大肠杆菌有明显细胞壁破裂现象，细胞内容物释放出来。纳米银颗粒能够累积在细胞膜上，攻击细胞膜磷脂双分子层，破坏菌体细胞膜的性质，使膜的通透性发生改变，大量还原糖和蛋白质从菌体内泄漏到胞外。将大肠杆菌短期暴露在纳米银中，纳米银会导致包膜蛋白前体的积累，使菌体中五种包膜蛋白表达异常。大肠杆菌细胞膜被破坏，降低其膜电位，细胞内ATP水平降低，大量新陈代谢所必需的物质泄漏，导致了细菌的死亡。[4]

4 结论

纳米银的抗菌作用较强，浓度越高其抗菌效果越强。与纳米纤维抗菌性对比其具有较强的抗菌效果，是很好的抗菌材料。纳米银作为一种新型的抗菌和杀菌材料，在普遍的抗药菌及耐药菌的抑制方面，具有良好的应用前景。

参考文献

[1] 苏甜甜.铜绿假单胞菌鞭毛及生物膜调控蛋白FleQ和糖苷水解酶Ps1G的结构与功能研究[D].2015.

[2] 何炳洪，谭妙娟，劳小斌.204株铜绿假单胞菌耐药性分析[J].现代医学，2012，40（4）：397-399.

[3] 曹雪玲，陆书来，张东杰，等.纳米银作为抗菌剂的抗菌性能研究[J].吉林化工学院学报，2017， 34（11）：30-34.

[4] 王燕，秦社宣，邵永珍，et al.纳米银体外对三种微生物的抑制作用及机制[J].中国微生态学杂志，2018.