免疫球蛋白G4相关硬化性胆管炎中黏膜相关恒定T细胞的免疫生物学特性

免疫球蛋白G4相关硬化性胆管炎(IgG4-SC)是一种发病机制不明、由异常免疫介导的慢性纤维化自身免疫性疾病，其特征包括：以辅助性T细胞2(Th2)免疫主导，持续活化的成熟B淋巴细胞以及分泌高水平的血清免疫球蛋白G4(IgG4)[1]。IgG4-SC好发于60岁以上老年男性，目前其诊断尚无金标准，需结合临床表现和实验室、影像学及病理学检查结果进行确诊[2]。黏膜相关恒定T细胞(MAIT)是一类固有免疫T细胞[3]。近年来的研究结果显示，MAIT细胞在自身免疫性疾病及非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)中均起到了重要作用[4-6]。目前MAIT细胞在IgG4-SC中的作用尚不明确，本研究旨在揭示IgG4-SC患者的MAIT细胞表型变化及其与临床指标的相关性，并探讨MAIT细胞在IgG4-SC发生、发展中的作用。

1 资料与方法

1.1 主要试剂

淋巴细胞分离液(Ficoll-pague)购自美国GE Healthcare公司，二甲基亚砜(DMSO)购自美国Sigma公司，CD3、CD4、CD8、CD161、干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、颗粒酶B(GrB)和白细胞介素-17(IL-17)等流式抗体购自美国BD Biosciences公司，CD8、Vα7.2和CXCR6等流式抗体购自美国BioLegend公司，细胞固定破膜剂购自美国BD Biosciences公司。

1.2 研究对象

收集自2016年3月至2018年5月在仁济医院消化科就诊的18例IgG4-SC患者的外周血标本。采用2011年日本学者通过研讨会制定的诊断标准[7]：(1)影像学等检查显示单个或多个器官局灶性或弥漫性肿大或包块表现；(2)血清学检查显示IgG4水平高于正常值上限(≥135 mg/dL)；(3)肝脏活组织病理检查显示大量淋巴细胞和浆细胞浸润伴显著纤维化，IgG4阳性浆细胞浸润(判断标准为IgG4阳性细胞占IgG阳性细胞比例>40%或每个高倍镜视野下>10个IgG4阳性浆细胞)。根据上述3项检查结果，符合(1)+(2)+(3)要求的为确诊，符合(1)+(3)要求的为拟诊，符合(1)+(2)要求的为疑诊。本研究纳入的患者均为确诊的IgG4-SC患者，且排除其他急、慢性肝病史。18名健康对照者(HC)的外周血标本于2017年1月至2018年1月采集于上海交通大学医学院附属仁济医院体检中心检验科，所有入选标本均保证血常规、血液生物化学、输血全套以及甲状腺功能检测结果无明显异常，且排除其他急、慢性肝病史。本研究所有入选者均知情同意，本研究方案获得医院伦理委员会的审批。

1.3 收集资料

收集IgG4-SC组和HC组的一般资料和实验室检查资料。一般资料包括年龄、性别等。实验室检查包括：(1)血常规指标 包括白细胞计数(WBC)、血红蛋白(Hb)、血小板计数(PLT)等；(2)生物化学指标 包括丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、γ-谷氨酰转移酶(GGT)、碱性磷酸酶(ALP)、总胆红素(TBil)、直接胆红素(DBil)等；(3)免疫学指标 包括IgG4、IgG等。

1.4 统计学方法

采用SPSS 22.0及GraphPad Prism 6.0统计软件进行分析。计量资料以均数±标准差表示，两样本均数比较采用非配对t检验分析，相关性采用Spearman′s rank correlation分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组的一般情况及实验室指标比较

本研究最终纳入18例IgG4-SC患者和18名健康对照者。两组中男性均为12例，女性均为6例。IgG4-SC组年龄为30～78岁，HC组年龄为36～67岁。两组在性别和年龄方面的差异均无统计学意义。实验室指标检测结果显示，与HC组相比较，IgG4-SC组的肝损伤较明显，IgG4-SC组的ALT和AST高于HC组。此外，IgG4-SC组的胆汁淤积也更明显。详见表1。

表1 两组的一般情况及临床资料比较

注：—为数据缺失；与HC组对比，aP<0.05，bP<0.01，cP<0.000 1

2.2 两组的外周血MAIT细胞频率比较

在本研究中，外周血MAIT细胞被定义为CD3+Vα7.2+CD161high淋巴细胞[8]。通过流式细胞术比较IgG4-SC组与HC组外周血中的MAIT细胞频率，发现前者较后者显著下降[(1.03±0.17)%比(3.72±0.68)%，P<0.001，图1A]。进一步分析IgG4-SC组与HC组外周血中MAIT细胞亚群的频率变化，发现两组外周血CD4+MAIT占总T细胞的比例差异无统计学意义[(0.10±0.02)%比(0.11±0.01)%，P=0.605 4，图1B]，而前者的CD8+MAIT和CD4-CD8-MAIT(DN MAIT)占总T细胞的比例均较后者降低[(2.37±0.43%)比(11.62±2.70)%，P<0.01；(2.98±0.91)%比(8.80±1.88)%，P<0.01，图1C～1D]。进一步分析IgG4-SC组与HC组外周血中3种MAIT细胞占总MAIT的比例，发现前者的CD4+MAIT占MAIT细胞的比例较后者升高[(8.65±2.83)%比(2.67±0.96)%，P=0.049 6，图1E]，而两组的CD8+MAIT和DN MAIT占MAIT细胞的比例差异均无统计学意义[(81.89±3.08)%比(84.58±1.97)%，P=0.451 5；(11.25±2.34)%比(10.74±1.16)%，P=0.842 2，图1F～1G]。

注：两组相比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，ns为差异无统计学意义

图1两组的外周血中MAIT细胞及各亚组MAIT细胞频率比较AT细胞中MAIT细胞频率BCD4+MAIT细胞在T细胞中的占比CCD8+MAIT细胞在T细胞中的占比DDN MAIT细胞在T细胞中的占比ECD4+MAIT细胞在MAIT细胞中的占比FCD8+MAIT细胞在MAIT细胞中的占比GDN MAIT细胞在MAIT细胞中的占比

2.3 外周血MAIT细胞频率与实验室指标的关系

为进一步了解IgG4-SC患者外周血中MAIT细胞频率的临床意义，本研究将外周血中MAIT细胞的比例与实验室指标进行相关性分析。在血常规指标方面，IgG4-SC患者较高的MAIT细胞频率与较多的PLT数量有关(r=0.58，P<0.05，图2A)。在免疫学指标方面，MAIT细胞频率与IgG4、IgG均无相关性(r=-0.06，P=0.802 1；r=-0.29，P=0.275 6；图2B、2C)。在肝功能指标方面，IgG4-SC患者的MAIT细胞频率与TBil、DBil均无相关性(r=-0.42，P=0.135 2；r=-0.131 4，P=0.202 8；图2D、2E)。虽然IgG4-SC患者的MAIT细胞频率与ALP无相关性(r=-0.45，P=0.110 4，图2F)，但其与GGT呈负相关(r=-0.81，P<0.001，图2G)。IgG4-SC患者的MAIT细胞频率与反映肝损伤的ALT、AST呈负相关(r=-0.60，P<0.05；r=-0.58，P<0.05；图2H、2I)，提示外周血MAIT细胞频率在一定程度上可反映IgG4-SC患者的疾病严重程度。

图2IgG4-SC患者外周血中MAIT细胞频率与实验室指标的相关性分析AMAIT细胞频率与PLTBMAIT细胞频率与IgG4CMAIT细胞频率与IgGDMAIT细胞频率与TBilEMAIT细胞频率与DBilFMAIT细胞频率与ALPGMAIT细胞频率与GGTHMAIT细胞频率与ALTIMAIT细胞频率与AST

2.4 外周血MAIT细胞分泌细胞因子变化

本研究对比分析了两组外周血中MAIT细胞分泌细胞因子的功能，发现相较于HC组，IgG4-SC组分泌GrB、IFN-γ和TNF-α的MAIT细胞比例均升高[(13.78±5.09)%比(1.82±0.66)%，P<0.05；(21.03±2.97)%比(11.72±1.93)%，P<0.05；(18.07±3.19)%比(4.98±1.20)%，P<0.001；图3A～3C]，而两组分泌IL-17的MAIT细胞比例差异无统计学意义[(1.07±0.23)%比(1.10±0.38)%，P=0.962，图3D]。

注：两组相比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，ns为差异无统计学意义

图3两组外周血中分泌各种细胞因子的MAIT细胞比例的比较A分泌GrB的MAIT细胞比例B分泌IFN-γ的MAIT细胞比例C分泌TNF-α的MAIT细胞比例D分泌IL-17的MAIT细胞比例

2.5 外周血中MAIT细胞向肝脏趋化能力变化

通过流式细胞术检测MAIT细胞CXCR6的表达情况，发现与HC组相比，IgG4-SC组外周血中CXCR6阳性的MAIT细胞比例显著升高[(36.25±6.54)%比(13.53±1.36)%，P<0.001，图4]。IgG4-SC组MAIT细胞表达趋化因子受体CXCR6升高，提示IgG4-SC患者的MAIT细胞向肝脏趋化增多。

注：两组相比较，**P<0.01

图4两组外周血中CXCR6阳性的MAIT细胞比例比较

3 讨论

IgG4-SC是一种好发于60岁以上男性的慢性纤维性炎性疾病，其临床表现多样，确诊需结合临床表现、实验室检查、影像学和病理学等，以防误诊为恶性肿瘤和其他自身免疫性肝病[2,9]。IgG4-SC是近年被医学界所认识的新型疾病，其发病机制尚不清楚。以往的研究显示，适应性免疫细胞和固有免疫细胞如T细胞、B细胞、巨噬细胞在IgG4-SC的发生发展中起着重要的作用[10-13]。

MAIT作为一类免疫细胞，由于其既具有固有免疫细胞的特性，又具有获得性免疫细胞的功能，故其在临床和基础研究中都受到了重视[14-16]。多篇文献报道MAIT细胞在不同疾病患者的外周血中频率降低，如自身免疫性肝病[4]、系统性红斑狼疮[17]、炎症性肠病[8]和NAFLD[5]等。在这些研究中，外周血中MAIT细胞频率降低均伴随着炎性反应部位(如发生炎性反应的肠道黏膜或肝脏)MAIT细胞频率升高。在本研究中，外周血中MAIT细胞被定义为CD3+Vα7.2+CD161high淋巴细胞。MAIT细胞主要包括CD8+MAIT、DN MAIT以及少量的CD4+MAIT[3]。通过流式细胞术发现IgG4-SC组的外周血MAIT细胞频率较HC组降低，同时MAIT细胞分泌细胞因子的功能亦发生改变，分泌GrB、IFN-γ和TNF-α等细胞因子能力的增强，而两组分泌细胞因子IL-17的能力差异无统计学意义。MAIT细胞在不同疾病中呈现的功能与基础状态也有差异性。有研究报道MAIT细胞在疾病状态中分泌的细胞因子由Th1型向Th17型转变[6,18]；也有研究发现小鼠MAIT细胞在体外被激活后，可分泌INF-γ、IL-4、IL-5和IL-10[19]；这些不同疾病中MAIT细胞功能的差异提示，其在不同疾病中发挥的生物学功能可能不尽相同。由于缺乏IgG4-SC患者的肝脏标本，故无法通过免疫荧光激光共聚焦技术或流式细胞术等方法确定IgG4-SC组肝脏中MAIT细胞频率是否较HC组升高。此外，目前尚无理想的IgG4-SC动物模型，故无法利用动物实验来判断MAIT细胞是否在肝脏部位聚集。有研究显示，趋化因子受体CXCR6在自身免疫性肝病患者的淋巴细胞迁移到肝脏中起着重要作用[20]。相较于HC组，IgG4-SC组MAIT细胞高表达CXCR6，提示IgG4-SC患者外周血中MAIT细胞极可能被募集到炎性反应部位。此外，在本研究中IgG4-SC组外周血MAIT细胞频率降低与ALT、AST和GGT等实验室指标密切相关。

综上所述，本研究探究了IgG4-SC患者外周血中MAIT细胞的表型和功能改变，以及MAIT细胞频率与实验室指标的相关性。本研究的局限性在于临床样本数量少以及缺乏肝脏标本，本研究结果有待今后的多中心、大样本研究来证实。MAIT细胞在IgG4-SC疾病发生、发展过程中发挥着重要作用，有望在将来成为治疗IgG4-SC的新的免疫细胞靶点。