8 个马大杂种相思无性系组培快繁试验初报

曾少玲，罗建华，容世清，曾凯，吴章丽

（湛江市林业科学研究所，广东湛江 524037）

马大杂种相思（Acacia mangium×A.auriculifor-mis）属含羞草科金合欢属，是以马占相思（Acacia mangium）为母本，大叶相思（A.auriculifor-mis）为父本选育而成[1］，既有大叶相思极强的抗瘠薄特性及树杆通直，分枝细小的特点，又具备马占相思的速生、根瘤因氮涵养水源的性能，二者已作为较好的改良树种在我国南方大量种植[2］，具有相当显著的生态效益、经济效益和社会效益。马大相思作为目前营造短周期工业用材林的主要树种，是工业造纸、家具装饰的好材料。由于其优质、速生、适应性强的特点，既可作为用材林和水土保持林树种进行纯林种植，亦可作为多功能混交林进行推广应用。现在很多地区还把马大相思与木麻黄混交营造防护林，马大相思与桉树混交营造经济林，其生长和防风效果也得到明显改善，另外高速公路的景观林带建设，国防道路两旁的绿化、防噪声和吸尘也应用该树种。开展马大相思的组培快繁关键技术研究，对促进该树种的发展和林木良种选育等方面具有重要意义。目前，对马大杂种相思离体快繁技术研究已有报道，且有效增殖倍数低、芽苗质量较差、增殖芽可用于生根诱导的数量极少[3］，移栽存活率仅80.4%[4］。试验通过筛选及引进的8 个无性系号的优良单株，分别取其当年新生枝条的带腋芽茎段为外植体进行组培快繁的研究，从影响外植体诱导、增殖、瓶内生根、驯化与移栽等因素入手，对8 个马大杂种相思的组培快繁开展了系统的研究，制定了从增殖倍率、生根率及瓶内生根生产能力的综合评价体系，筛选认定最佳的可形成瓶内生根生产能力并规模工厂化生产苗木的品号，为马大杂种相思的良种选育及推广种植奠定基础。

1 材料与方法

1.1 植株来源和试验材料

从湛江市林业科学研究所收集和引种的马大相思基因库中，选出8 个无性系号，其中2 个无性系是从中国林科院引进的10＃、73＃，另外6 个无性系号LK1、LK2、LK3、SK1、SK2、SK3。其中，LK1、LK2、LK3是从中国林业科学院热带林业研究所马大杂种相思试验林中选取干型通直的抗风优树的当年生枝条的腋芽进行扦插所获得的单株，SK1、SK2、SK3 是从湛江森科公司取得的优良无性系单株。从8 个无性系的优良单株中分别取其当年新生枝条的带腋芽茎段为外植体进行组培快繁研究。

1.2 培养条件

培养室温度为28℃，光照约2500Lx，光照时间约14h/d，外植体诱导的第一个星期采用暗培养。

1.3 试验方法

1.3.1 外植体消毒试验

8 个无性系的萌芽枝条由专人精心管理，采集萌芽前的2 周内对萌芽条喷洒2 次2g/L 的多菌灵溶液。分别剪取8 个号的萌芽条，贴上标签，再用湿沙布包扎好拿回室内，分顶端幼嫩枝段（含第1～2个腋芽）和中段（含3～5 个腋芽）及下段（6～7）三类型进行外植体消毒[5]。用软毛刷沾清水混合少量洗衣粉消毒芽条，清洗大部分的粉尘，再用自来水反复冲洗，然后把芽条按幼嫩部分、中段和下段部分分类放入装有无菌水的培养瓶中。于无菌工作台上，采用3 种方法对三类枝条分类处理消毒。方法1：先用70%酒精浸泡15s 后，用无菌水冲洗3～4 次，后0.1%升汞浸5～6min 后，用无菌水冲洗3～4 次。方法2：先用2%次氯酸钠消毒2min，无菌水冲洗3～4次，再用0.1%升汞5～6min，无菌水冲洗3～4 次。方法三：0.1%升汞5～6min，无菌水冲洗3～4 次。

1.3.2 外植体诱导

以MS 为基本培养基，加入6-BA 1.0mg/L+NAA 0.2mg/L，添加3%白糖、0.6%琼脂，pH 值为5.8。外植体接种一次后即进入增殖培养。将消毒后的外植体接种在MS 培养基上，每个处理接种50 瓶，每瓶接种1 株芽，重复3 次，15d 后统计存活率和出芽率。

1.3.3 增殖试验比较

外植体接种约20d 左右，没有褐变和污染的外植体会从节间萌发出小芽，将诱导出的芽转接到增殖培养基中开始扩繁，转入增殖培养阶段。增殖培养阶段对马大相思的8 个号的丛芽增殖的效果进行如下的观察和比较。

（1) 分裂素对增殖的影响

对初期表现较好的无性系号，以MS 为基本培养 基，分 别 添 加0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/L 的6-BA，附加NAA 0.1mg/L，探讨细胞分裂素对增殖的影响。

（2）同一无性系号对不同基本培养基的影响

对初期表现较好的无性系号，以6-BA0.4mg/L+NAA0.1mg/L，分别搭配MS、B5、WPM、1/2MS4 种不同大量元素，观察对分化的影响。

（3）相同培养基不同系号的增殖生长比较

采用基本培养基MS+6-BA0.4mg/L+NAA0.1mg/L，添加3%白糖、0.6%琼脂，pH 值为5.8。观察8 个无性系号每个月的有效芽数及计算增殖倍数，记录生长表现。

1.3.4 生根配方的筛选及各个号生根率比较

以1/2MS 为基本培养基，添加不同浓度的IBA（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.5、1.8、2.0）mg/L、NAA（0.2）mg/L 及NAA（0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.5、2.0）mg/L、IBA（0.2）mg/L，设计16 种生根培养基，当增殖材料达到50 瓶后，取1.5cm 长顶芽茎段接入生根培养基中，每个处理接种20 个茎段，重复3 次，25d 后调查生根苗的生长情况并统计生根率。计算每个号的生根百分率。观察瓶内生根表现，作出综合评价。

1.3.5 生根瓶苗的驯化和移栽

生根瓶苗在培养室15d 出根后，移到炼苗棚进行10～15d 炼苗，洗净根部的培养基后移栽到8cm×12cm 的经消毒过的营养袋中，移栽基质选择黄心土：河沙按一定比例。移栽前淋透水，移栽后每周期用1.25g/L 的甲基托布津溶液消毒，两周后转入苗圃常规管理，移栽时对8 个号作好标记，30d 后比较各个号的成活率和生长情况。

2 结果与分析

2.1 外植体消毒对初代培养的影响

2.1.1 不同无性系号的不同枝段外植体诱导效果比较

由表1 可知，外植体的消毒成功率与木质化程度有关[6]，木质化程度越高，污染率越高，新生顶芽内生菌含量少。但枝条幼嫩，容易被消毒剂杀死。对8 个无性系的三种类型的枝段的消毒成功率进行分析，中枝节段平均消毒成功率为26.5%、嫩枝节段平均消毒成功率为22.0%、老枝节段的消毒成功率为16.3%。三种枝段的平均腋芽分化率有一定的差异，其中中枝节段为53.8%、嫩枝节段为50%，老枝节段为47.2%。由此可总结出：枝条中上部半木质化的茎段出芽率高[7]，且污染率低[8]，因而当年生枝条第3～5 个腋芽茎段是马大相思理想的外植体材料。

由表2 可知，不同无性系之间的外植体消毒成功率和腋芽分化率有一定差异，8 个马大相思无性系的消毒成功率从高到低依次是SK1（30%）、10＃（27.3%）、SK2（25.3%）、73＃（22.7%）、LK1（19.3%）、LK2（16.7%）、LK3（16.0%）、SK3（15.3%），差异较大，最大的SK1（30%）比最小的SK3（15.3%）高14.7%。8 个马大相思无性系的腋芽分化率有差异，从高到低依次是SK1（66.7%）、10＃（63.4%）、73＃（61.7%）、SK3（56.5%）、LK3（45.8%）、LK1（41.4%）、LK2（40.0%）、SK2（39.5%），超过60%的前3 个是SK1（66.7%）、10＃（63.4%）、73＃（61.7%），最高的SK1（66.7%）比最低的SK2（39.5%）高27.2%。

表1 不同无性系号不同枝段外植体的消毒及腋芽分化情况Table 1 Disinfection and axillary Bud differentiation of branches and segments of different asexual lines

2.1.2 不同消毒剂及组合对芽消毒效果的影响

选择SK1 开展不同消毒剂消毒试验。由表3 可知，方法1 和方法2 的效果区别不大，而仅用0.1%升汞的成功率为15.0%。在使用两种消毒剂时务必掌握好消毒时间，否则芽枝容易因过分消毒而被杀死。

2.1.3 外植体消毒时间对初代培养的影响

该试验以10＃ 无性系的中枝节段为外植体，以70%酒精+0.1%升汞的消毒方法，先用70%酒精浸泡15s,无菌水冲洗3 次后，再用0.1%升汞消毒。消毒时间分别设置为4、6、8、10min，各用无菌水冲洗5 次。从表4 可知，升汞消毒时间对外植体的污染率和褐变率影响非常明显，消毒时间低于4min污染率达100%，消毒时间超过10min 后，成功率仅为12.9%。而消毒时间为6min 时，诱导成功率最高，诱导率达58.2%。所以外植体消毒以0.1%升汞为最理想的。

2.2 丛生芽诱导及增殖培养基的筛选

2.2.1 激素对增殖的影响

该试验以10＃无性系作为试验观察。由表5 可知，固定NAA 为0.1mg·L-1，当6-BA 为0.2mg/L 时，芽丛分化少，高生长明显，参差不齐，芽数少；当6-BA 为0.4mg/L 时，芽数多且粗，活力好，易操作；当6-BA 为0.6mg/L 时，芽数较多，节间短，较难操作；当6-BA 为0.8mg/L 时，芽数多且幼细，少量玻璃化，难操作；当6-BA 为1.0mg/L 时，芽数多且幼细，玻璃化，质量差，难操作。所以6-BA 最佳浓度以0.4mg/L 和0.6mg/L 为较适范围。

2.2.2 同一无性系号对不同培养基的影响

选用10＃开展无性系供试验。由表6 可知，三种培养基对芽的增殖倍率有明显的差异，其中MS 培养基对促进芽分化效果最显著，培养4 个月时已进入旺盛增殖期，倍率为2.95，6 个月为3.87；其次是B5，6 个月时为1.61；最差为WPM，6 个月才1.24。用MS 作为大量元素适合分化。

2.2.3 相同培养基不同系号的增殖生长比较

由表7 可知，8 个号的继代增殖倍率有区别，其中6 个月时增殖倍率从高到低依次是：SK1（3.99）、10＃（3.87）、73＃（3.53）、LK1（2.48）、LK2（2.37）、LK3（2.35）、LK3（2.34）、SK2（2.32）。所以从增殖倍率看，以SK1、10＃、73＃3 个号的增殖效果较好。

表3 同一无性系号不同消毒剂消毒效果比较Table 3 Comparison of disinfection effect of different disinfectants with the same asexual number

表4 外植体消毒时间对初代培养的影响Table 4 Effect of time of exfoliation on primary culture

表2 同一无性系号枝段外植体的消毒及腋芽总体分化情况Table 2 Disinfection and general differentiation of axillary buds of the same asexual branch)

表5 不同6-BA 对芽增殖的影响Table 5 Effect of different 6-BA on Bud proliferation

表6 同一无性系不同大量元素增殖效果比较Table 6 Comparison of proliferative effects of the same asexual lines and different quantities of elements

2.3 不同激素水平对瓶内生根的影响

选用SK1 无性系供试验。马大相思的组培瓶芽扩繁到一定的数量后，就开始转入生根试验。将长度为1～1.5cm 的芽接种于生根培养基中，30d 后观察根数及生长情况。由表8 可以看出：马大相思的生根激素水平以IBA0.6-1.2+NAA0.2 或NAA 0.6-1.2+IBA0.2 的范围比较合适。激素浓度太底，生根时间很慢，生出的根幼细。随着激素浓度的升高，生根时间会减慢，会促进根部愈伤组织的产生，容易出现畸形苗，苗木生长不正常，甚至会停止生长。NAA 和IBA 对马大相思的生根效果相差不大，只是使用浓度的高低对生根影响较大。通过比较，接种20d 时，生根培养基以V6：1/2MS+IBA1.2mg/L+NAA0.2mg/L和V13：1/2MS+NAA1.2mg/L+IBA0.2mg/L 的生根效果最好，生根率都达96%，生根数平均达3.6 条以上。

2.4 生根瓶苗的驯化和移栽试验

马大相思的生根瓶苗在培养室15d 出根后，在炼苗棚的自然光下进行炼苗10～15d，注意控制光照强度，以免光线太强灼伤组培苗。当驯化10～15d时，叶片呈深绿色、羽叶开展时，苗木比较健壮时从培养瓶中取出小苗洗干净基部培养基；之后移栽到8cm×12cm 的经消毒过的营养袋中，移栽基质选择黄心土，移栽前淋透水，移栽后每周用1.25g/L 的甲基托布津溶液消毒，两周后转入苗圃常规管理，移栽时对8 个号作好标记，30d 后比较各个号的成活率和生长情况。移栽后注意保湿遮荫，注意水肥和病虫害的控制。由表9 可知：各个号的平均成活率有一定的差异，超过80%是10＃（87.3%）、73＃（83.5%）、SK1（87.8%），其它号为75%左右。

由表10 可知：将组培苗移入已设定的4 种基质中，分别是黄心土：沙（1：0、1：1、2：1、3：1），一个月后调查成活率，将各个基质的成活率取平均值，其中以1：1 的成活率最高，达88.4%；其次是2：1（84.4%）；最低的为1：0（68.2%）。所以基质选择以黄心土：沙为1：1 效果是最合适的。

表8 不同激素水平对马大相思瓶内生根的影响Table 8 Effects of Different Hormone Levels on Roots in Acacia Ma Bottle

表9 8 个无性系号移栽成活率比较Table 9 Comparison of the survival rate of 8 asexual transplanting numbers

表10 8 个号的各种基质比例的平均成活率统计Table 10 Statistics on the average survival rate of various matrix ratios for 8 numbers

表7 同一培养基、不同无性系号的增殖效果比较Table 7 Comparison of proliferative effects of the same medium and different asexual lines

2.5 8 个马大相思无性系号试管内的综合评价

2.5.1 8 个无性系号7 个月时的增殖比较

由表11 可知，8 个号的继代增殖倍率有区别，其中6 个月时增殖倍率从高到低依次是：SK1（3.99）、10＃（3.87）、73＃（3.53）、LK1（2.48）、LK2（2.37）、SK3（2.35）、LK3（2.34）、SK2（2.32）。由表8可知：外植体增殖到7 个月时的继代瓶数由高到低依次是：SK1（463 瓶）、10＃（418 瓶）、73＃（286 瓶），SK3（26 瓶）、LK1（20 瓶）、SK2（18 瓶）、LK2（16 瓶）、LK3（10 瓶）、所以从增殖倍率看，以SK1、10＃、73＃3个号的增殖效果较好。

表11 同一培养基、不同无性系号的增殖效果比较Table 11 Comparison of proliferative effects of the same medium and different asexual lines

2.5.2 8 个无性系号瓶内生根生产能力比较

由表12 可知，将8 个无性系号的芽苗接入生根培养基V6：1/2MS+IBA1.2mg/L+NAA0.2mg/L，每个号取5 瓶增殖芽接入生根培养基，每瓶可取芽枝接入生根的株数最多的3 个号是SK1（67 株）、10＃（60株）、73＃（46 株），折合生根瓶数依次是SK1（3.4瓶）、10 ＃（3.0 瓶）、73＃（2.3 瓶），且3 个号的生根率都达90%以上。

表12 8 个无性系的生根能力比较Table 12 Comparison of rooting capacity of eight asexual lines

一个树种的组培快繁能否在瓶内形成生产能力，要看增殖倍率25d 一个周期要达2.5 倍以上，每瓶可取用于生根的株数达40 株以上，同时生根率达90%以上。达到这3 个指标，才算在试管内可形成生产能力。8 个马大相思无性系号从增殖倍率、生根率及瓶内生根生产能力综合评价，只有SK1、10＃、73＃3 个号可形成瓶内生根能力，可在试管内规模工厂化生产苗木。

3 结论与讨论

(1)外植体的消毒成功率与芽条木质化程度有关，枝条中上部半木质化的茎段出芽率高，且污染率低，马大相思理想的外植体材料是当年生枝条第3～5 个腋芽茎段。两种消毒方法（70%酒精+0.1%升汞）和（2%次氯酸钠+0.1%升汞）对消毒效果没多大区别，成功率都达30%以上，而仅用0.1%升汞的成功率只有15.0%。在使用两种消毒剂时务必掌握好消毒时间，低于4min 污染率达100%；超过10min 后，枝条容易消毒过度，成功率仅为12.9%；而6min 是最合适的，诱导率达58.2%。马大相思不同无性系之间的外植体消毒成功率和腋芽分化率有一定差异，消毒成功率最好的三个是SK1 （30%）、10 ＃（27.0%）、SK2（25.4%），腋芽分化率最高的三个是SK1（66.7%）、10＃（63.4%）、73＃（61.7%）。

（2）增殖效果与6-BA 浓度有关，固定NAA 为0.1mg/L，6-BA 最佳浓度以0.4mg/L 和0.6mg/L 为较适范围。过低，芽丛分化少，高生长明显，参差不齐；浓度过高，芽数多且幼细，玻璃化，质量差，难操作。同时与基本培养基有关，通过三种基本培养基MS、B5、WPM 的分化试验，其中MS 培养基对促进芽分化效果最显著，培养4 个月时已进入旺盛增殖期，6个月的倍率为3.87；其次是B5，6 个月倍率为1.61；最差为WPM，6 个月倍率是1.24。选用MS 作为大量元素最适合分化基本培养基。通过试验选择8 个号的继代增殖倍率以SK1、10＃、73＃3 个号的增殖效果较好。

(3)瓶内生根培养以V6：1/2MS+IBA1.2mg/L+NAA0.2mg/L 和V13：1/2MS+NAA1.2mg/L+IBA0.2mg/L的生根效果最好，生根率都达96%，生根数平均达3.6 条以上。

(4)对8 个号的移栽的平均成活率有一定的差异，超过80%是10＃（87.3%）、73＃（83.5%）、SK1（87.8%），其它号为75%左右。移栽基质选择以黄心土：沙为1：1 效果最合适的。

(5)8 个马大相思无性系号从增殖倍率、生根率及瓶内生根生产能力综合评价，只有SK1、10＃、73＃3 个号可形成瓶内生根能力，可在试管内规模工厂化生产苗木。