土家族脑卒中患者MTHFR、MTRR67基因单核苷酸多态性及其与血清同型半胱氨酸水平的关系

熊小平，谭小燕，冯云，杨章琴，李锐，田小龙

(重庆市黔江中心医院，重庆409000)

脑卒中为脑血管破裂或闭塞后引起突发神经功能缺损的一类临床综合征，是致残致死率极高的疾病之一,分为缺血性脑卒中和出血性脑卒中[1]。脑卒中高危因素包括遗传基因、高血糖、不良生活方式、高血压、高脂血症等，与心血管疾病高危因素相似[2]。研究证实，高同型半胱氨酸血症为心血管疾病及脑卒中独立高危因素[3]。亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)和蛋氨酸合成酶还原酶(MTRR)是叶酸代谢过程中的关键酶，其中MTHFR基因最常见突变位点为677、1298位[4～7]，MTRR基因最常见突变位点为66位，两种基因不同位点突变均会导致血浆同型半胱氨酸水平升高。但是，MTHFR、MTRR基因突变与脑卒中的发病是否有关目前的研究结果尚无定论。另有研究[8]表明，MTHFR基因677位点的等位基因和基因型分布具有较强的地域和人种特征，突变型T等位基因频率由低到高依次为非洲人、欧洲白人、中东人、中国汉族人、墨西哥。国内研究[2，5，9]结果也显示，不同民族、不同地区间MTHFR基因677、1298位点基因型分布存在明显差异。重庆市黔江区为土家族聚集区，有独特的民族特点，该地区脑卒中发病率也有逐年上升趋势，目前尚无针对该民族脑卒中患者MTHFR、MTRR基因多态性研究,我们就该地区土家族脑卒中患者MTHFR、MTRR基因SNP及其与同型半胱氨酸水平的关系进行了探讨。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2017年9月～2018年8月在黔江中心医院住院治疗的土家族脑卒中患者92例(脑卒中组),均符合《2016中国脑血管病诊治指南及专家共识》中的脑卒中诊断标准。男49例、女43例，年龄(63±14)岁。糖尿病38例、高血压72例，高血脂47例。病程<7 d。其中，脑出血9例，脑梗死68例，短暂性脑缺血发作15例。纳入标准：年龄40～80岁；有明确的脑血管疾病的定位体征如偏瘫、肢体麻木、失明、失语、吞咽困难、感觉障碍等；影像学检查诊断明确。排除动脉瘤、血液系统疾病、肿瘤、外伤、心源性栓塞等疾病。选择同期本院体检健康土家族人员140例作为对照组，男88例、女52例，年龄(61±15)岁。纳入标准：年龄40～80岁；无脑血管病病史；头颅MR提示无脑卒中证据。两组年龄、性别有可比性。

1.2 MTHFR、MTRR基因不同位点单核苷酸检测及基因分型 ①DNA提取及扩增：采集受检者口腔黏膜上皮脱落细胞，采用硅胶吸附法提取基因组DNA。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司使用HPLC纯化方法合成。PCR反应体系： 1 μL基因组DNA(20 ng/μL)，5 μL Taqman Universal Master Mix，0.5 μL Taqman-MGB探针(MTHFR677T/C GAAAAGCTGCGTGATGATGAAATCG[G/A]CTCCCGCAGACACCTTCTCCTTCAA；MTHFR 1298C/A AAGAACGAAGACTTCAAAGACACTT[G/T]CTTCACTGGTCAGCTCCTCCCCCCA；MTRR 66G/AAGGCAAAGGCCATCGCAGAAGAAAT[A/G]TGTGAGCAAGCTGTGGTACATGGAT)，3.5 μL去离子水，总反应体积为10 μL。PCR反应条件：95 ℃预变性10 min，92 ℃变性15 s，60 ℃延伸1 min，20个循环；89 ℃变性15 s，60 ℃延伸90 s，30个循环。②单核苷酸检测及基因分型：将PCR扩增完成样品置于ABI QuantStudio DX荧光定量PCR仪上读取样品孔的终点荧光，并使用QuantStudio DX Software分析软件实现对MTHFR C677T的野生纯合型(CC)、杂合型(CT)、突变纯合型(TT)，MTHFR A1298C的野生纯合型(AA)、杂合型(AC)、突变纯合型(CC)与MTRR A66G的野生纯合型(AA)、杂合型(AG)、突变纯合型(GG)的SNP分型，相关仪器及试剂均购于美国AB公司。

1.3 血清同型半胱氨酸水平检测 空腹条件下采集血液2 mL至ED-TAK3抗凝管中，于3 000 r/min、4 ℃离心机中离心10 min(采血后1 h内完成离心)，分离上层血浆。采用高效液相色谱法检测血清同型半胱氨酸，检测值> 15 μmol/L定义为高同型半胱氨酸血症。

2 结果

2.1 两组MTHFR基因677、1298位点及MTRR基因66位点基因型、等位基因分布比较 两组各基因型频率均符合Hardy-Weinberg平衡(MTHFR基因677位点：χ2分别为0.028、0.13，P均>0.05；MTHFR基因1298位点；χ2分别为0.02、0.23，P均>0.05；MTRR基因66位点：χ2分别为5.07、2.98，P均>0.05)，具有群体代表性。MTHFR基因667位点等位基因分别为CC、TT、CT；两组基因型及等位基因分布比较差异无统计学意义(χ2分别为1.32、1.08，P分别为0.25、0.58)，结果详见表1。MTHFR 1298位点等位基因分别为CC、AA、AC型；两组基因型及等位基因分布比较差异无统计学意义(χ2分别为0.49、0.77，P分别为0.48、0.68)，结果详见表2。MTRR基因66位点等位基因分别为AA、AG、GG型。与对照组相比，脑卒中组MTRR基因66位点GG基因型比率上升，AG基因型比率下降(χ2=15.13,P<0.01;χ2=5.58,P<0.05)；两组等位基因分布比较，χ2=0.96，P=0.33；结果详见表3。MTHFR基因677、1298位点及MTRR基因66位点SNP与脑卒中发生无明显相关性(OR分别为1.13、1.06、1.25，95%CI分别为0.81～1.58、0.58～1.91、0.79～1.99；P均>0.05)。

表2 两组MTHFR 1298位点基因型及等位基因分布

表3 两组MTRR基因66位点基因型及等位基因分布

2.2 MTHFR基因677、1298位点及MTRR基因66位点不同基因型脑卒中患者血清同型半胱氨酸水平比较 232例受试者MTHFR基因677位点基因型为CC、TT、CT者血清同型半胱氨酸水平分别为(14.36±0.78)、(24.67±5.59)、(15.12±0.69)μmol/L；MTHFR 1298C/A基因型为CC、AA、AC者血清同型半胱氨酸水平分别为(14.14±2.13)、(18.08±1.58)、(13.23±0.77)μmol/L；MTRR基因66位点基因型为AA、AG、GG者血清同型半胱氨酸水平分别为(15.23±0.87)、(16.45±1.95)、(21.84±5.13)μmol/L。MTHFR基因677位点TT基因型血清同型半胱氨酸水平高于CC、CT基因型(P均<0.05)。MTHFR基因1298位点及MTRR基因型66位点不同基因型之间血清同型半胱氨酸水平相比差异均无统计学意义(F1=2.16,F2=1.67;P均>0.05)。

3 讨论

MTHFR基因定位于染色体1p36.3[4]，其突变可导致酶需热性和活性减低，主要功能为催化5，10-亚甲基四氢叶酸还原为5-甲基四氢叶酸，其基因突变会导致同型半胱氨酸复甲基化障碍，使得血清同型半胱氨酸浓度升高，从而导致多种疾病发生。目前MTHFR基因多态性与缺血性脑卒中关系存在争议[10,11]，一部分研究[12]认为该基因与脑卒中发病有关，甚至与儿童卒中发病也存在一定关系；但另一部分研究[13]认为，MTHFR基因突变与脑卒中发病无关。本研究发现，脑卒中患者MTHFR基因677位点TT基因型同型半胱氨酸水平高于CC、CT基因型，说明MTHFR基因677位点TT基因型与高同型半胱氨酸血水平有关；但是，MTHFR基因677、1298位点SNP与脑卒中之间无明显相关性。表明虽然MTHFR基因677位点突变可能降低亚甲基四氢叶酸还原酶的活性，引起同型半胱氨酸升高，但并非脑卒中的高危因素，与文献[14]报道结果一致。本研究结果显示，卒中组MTHFR基因1298位点各基因型分布与对照组相比差异无统计学意义，不同基因型之间血清同型半胱氨酸水平相比差异均无统计学意义，且与脑卒中发生无关联，与文献[15]报道相似。说明MTHFR基因1298位点突变可能与高同型半胱氨酸血水平及脑卒中发生无关。

MTRR为蛋氨酸代谢中的一个关键酶，基因错义突变是引起此酶缺乏或活性降低的主要原因,其中66位碱基突变最常见，其主要作用是维持血浆同型半胱氨酸浓度，66位点基因变异可引起血浆同型半胱氨酸浓度升高[16～18]。文献报道，朝鲜族及汉族MTRR基因66位点GG基因型频率分别为11.11%及5.03%，朝鲜族人群中MTRR基因66位A突变为G增加脑卒中风险。本研究中，黔江区土家族脑卒中患者MTRR基因66位点GG亚型频率高达19.6%，高于文献报道的朝鲜族及汉族，说明黔江区土家族该基因的分布具有自身民族特点，可能存在连锁不平衡现象，需进一步研究证实。本研究发现，与对照组比较，卒中组MTRR 66位点GG型基因比率上升，提示脑卒中患者MTRR 66位点GG基因型可能增加患者的卒中风险，但Logistic分析显示该基因OR值为1.25，与脑卒中发生无关联性，提示该基因可能不是脑卒中的独立危险因素[19]。MTRR基因型66位点不同基因型之间血清同型半胱氨酸水平相比差异均无统计学意义，说明MTRR基因型66位点突变与高同型半胱氨酸水平无关。

总之，土家族脑卒中患者MTRR基因66位点GG基因型比率上升，AG基因型比率下降；MTHFR基因677位点TT基因型与脑卒中患者高同型半胱氨酸水平有关；MTHFR、MTRR基因SNP与脑卒中发生无关。鉴于本研究中纳入的研究样本偏少，可能存在实验偏差，仍需进一步扩大样本量以明确上述两种基因SNP与高同型半胱氨酸水平及脑卒中的关系。