复方白花蛇舌草胶囊抗肿瘤作用的初步研究

覃明雄 ，陈洪涛 ，蔡丹昭 ，刘源焕 ，罗宇东 ，李芳婵

（1.广西中医药大学制药厂，广西 南宁 530023；2.广西医科大学，广西 南宁 530022；3.广西中医药大学，广西 南宁 530200）

恶性肿瘤的发病率逐年上升，已极大威胁人类健康［1］。中药治疗肿瘤具有多靶点、不易产生耐药性等优势，已经成为抗肿瘤新药研发的新方向［2］。复方白花蛇舌草胶囊是广西中医药大学第一附属医院在筛选广西壮瑶少数民族民间治疗肝癌、肺癌验方的基础上，遵循中药组方基本原则并结合壮瑶药材的特点，选用白花蛇舌草、半枝莲、白花丹、紫草、山豆根、蒲葵子、防己、白英、石上柏、小叶金花草、八月札等20味广西特色药材进行组方，具有清热解毒、止血镇痛、消肿化瘀、益气固本的功效，临床上用于肝癌、肺癌的辅助治疗效果良好。本课题组将该处方研制成胶囊，并对其进行了抗肿瘤的药效实验研究，为复方白花蛇舌草胶囊进入临床实验提供依据。

1 实验材料

1.1 动物 昆明种小鼠，雄性，体重18～22 g，生产许可证号：SCXK桂2014-0003；SD大鼠，雄性，体重180～200 g，生产许可证：SCXK 桂 2014-0002；均购自广西医科大学实验动物中心。

1.2 试药 复方白花蛇舌草胶囊干膏粉（由广西中医药大学制药厂提供）。

1.3 细胞株及瘤株 BEL-7402株（人肝癌细胞）、HepG2株（人肝癌细胞）均购自武汉博士德生物工程有限公司；S180及H22肝癌腹水型种鼠购自广东省医学实验动物中心。

1.4 仪器和试剂 CCK-8检测试剂盒（日本同仁化学研究所）；DMEM全培养基（武汉博士德生物工程有限公司）；0.25%胰蛋白酶（武汉博士德生物工程有限公司）；吉姆萨工作液（Solarbio）；ALT、AST、TB 检测试剂盒（南京建成生物工程研究所）；酶标仪（美国Thermo，Multiskan Go 1510-00607c）；细胞成像仪（美国EVOS FL Auto）。

2 方法与结果

2.1 复方白花蛇舌草胶囊含药动物血清的制备 取雄性SD大鼠39只，随机分为4组：空白组3只，复方白花蛇舌草胶囊高、中、低剂量组（剂量分别为14.84 g/kg、7.42 g/kg、3.71 g/kg）每组 12 只。给药组按10 ml/kg体积灌胃给予相应药物，空白组予等量生理盐水，每天1次，连续7 d。在末次给药30 min、60 min、90 min、120 min，复方白花蛇舌草胶囊各剂量组分别取3只大鼠经腹主动脉采血分离血清，置-20℃冰箱保存备用，临用前56℃、30 min灭活。

2.2 复方白花蛇舌草胶囊含药血清对肿瘤细胞克隆的影响 取对数生长期的HepG2、BEL-7402细胞，消化计数，按103个/孔接种于6孔板中，设置空白对照组和含药血清高、中、低剂量组（末次给药后60 min），每组平行4孔含药血清各剂量组作用24 h后更换培养基，37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中静置培养14 d，每日观察，至出现肉眼可见细胞克隆时，终止培养，弃去培养基，PBS清洗，甲醇固定15min，吉姆萨染液染色40min，流水冲洗，晾干，于显微镜下观察并计数大于50的细胞克隆数。见表1、表2及图1、图2。

表1 复方白花蛇舌草胶囊含药血清对HepG2细胞克隆的影响 （n=4，±s）

表1 复方白花蛇舌草胶囊含药血清对HepG2细胞克隆的影响 （n=4，±s）

注：与空白对照组比较，①P＜0.05

组 别 剂量（g/kg）克隆形成数空白对照组 — 92.51±10.30含药血清高剂量组 14.84 64.33±12.16①含药血清中剂量组 7.42 78.19±9.07含药血清低剂量组 3.71 89.54±12.63

表2 复方白花蛇舌草胶囊含药血清对BEL-7402 细胞克隆的影响 （n=4，±s）

表2 复方白花蛇舌草胶囊含药血清对BEL-7402 细胞克隆的影响 （n=4，±s）

注：与空白对照组比较，①P＜0.05

组 别 剂量（g/kg）克隆形成数空白对照组 — 114.46±15.34含药血清高剂量组 14.84 88.07±14.06①含药血清中剂量组 7.42 95.37±11.48含药血清低剂量组 3.71 107.16±13.55

图1 复方白花蛇舌草胶囊含药血清对HepG2细胞克隆的影响

表1、表2结果显示：与空白对照组比较，复方白花蛇舌草胶囊高剂量含药血清作用于HepG2、BEL-7402细胞后，细胞的克隆数目明显降低，有显著性差异（P＜0.05），中、低剂量组细胞克隆数有降低的趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05），提示复方白花蛇舌草胶囊含药血清可有效抑制HepG2、BEL-7402细胞的克隆形成。

图2 复方白花蛇舌草胶囊含药血清对BEL-7402细胞克隆的影响

2.3 复方白花蛇舌草胶囊含药血清对肿瘤细胞增殖的影响 取对数生长期的HepG2、BEL-7402细胞，制成5×104个/ml单细胞悬液，按每孔100 μl接种于96孔培养板中，于37℃、5%CO2条件下培养24 h。实验设立空白对照组及不同剂量含药血清组，每个剂量平行4孔，空白对照组加入等体积的DMEM培养基。加药完毕后继续孵育24 h，取出96孔板，每孔加入10 μl CCK-8溶液，继续孵育2 h，采用酶标仪于450 nm处测定各孔吸光度OD值。实验重复3次，计算药物对细胞的生长抑制率（IR）。抑制率=（1-实验组OD值/空白对照组OD值）×100%。结果见表3、表4。

表3 复方白花蛇舌草胶囊含药血清对HepG2细胞增殖的影响 （n=4，±s）

表3 复方白花蛇舌草胶囊含药血清对HepG2细胞增殖的影响 （n=4，±s）

OD值 IR OD值 IR OD值 IR OD值 IR空白对照组 — 0.67±0.11 — 0.67±0.11 — 0.67±0.11 — 0.67±0.11 —含药血清高剂量组 14.84 0.81±0.15 -20.9 1.03±0.14 -53.7 0.61±0.10 9.0 0.86±0.07 -28.4含药血清中剂量组 7.42 1.01±0.15 -50.7 0.53±0.07 20.9 0.56±0.11 16.4 0.77±0.06 -14.9含药血清低剂量组 3.71 0.64±0.21 4.5 0.62±0.06 7.5 0.65±0.14 3.0 0.66±0.13 1.5组 别 剂量（g/kg）30 min 60 min 90 min 120 min

表4 复方白花蛇舌草胶囊含药血清对BEL-7402细胞增殖的影响 （n=4，±s）

表4 复方白花蛇舌草胶囊含药血清对BEL-7402细胞增殖的影响 （n=4，±s）

OD值 IR OD值 IR OD值 IR OD值 IR空白对照组 — 0.89±0.16 — 0.89±0.16 — 0.89±0.16 — 0.89±0.16 —含药血清高剂量组 14.84 0.82±0.11 7.9 0.72±0.11 19.1 0.76±0.14 14.6 0.82±0.15 7.9含药血清中剂量组 7.42 0.90±0.08 -1.1 0.87±0.16 2.2 0.86±0.08 3.4 0.76±0.07 14.6含药血清低剂量组 3.71 0.94±0.17 -5.6 0.91±0.13 -2.2 0.91±0.09 -2.2 0.93±0.18 -4.5组 别 剂量（g/kg）30 min 60 min 90 min 120 min

表3、表4结果显示：与空白对照组比较，各剂量、各时间点的复方白花蛇舌草胶囊含药血清处理细胞后OD值无明显差异（P＞0.05），提示复方白花蛇舌草胶囊含药血清对HepG2、BEL-7402细胞增殖无明显抑制作用。

2.4 复方白花蛇舌草胶囊对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响 取小鼠50只，随机分成5组：空白对照组、香菇菌多糖片组（5 mg/kg）及复方白花蛇舌草胶囊高、中、低剂量组（剂量分别为 21.2 g/kg、10.6 g/kg、5.3 g/kg），每组10只。各给药组灌胃给予相应药物，空白对照组灌服等量蒸馏水，每天1次，连续7 d。末次给药后1 h，每只小鼠腹腔注射20%鸡红细胞悬液1 ml，0.5 h后脱臼颈椎处死动物，腹腔注射生理盐水2 ml，轻揉腹部1 min，用碘伏消毒腹部，剪开皮肤，抽取腹腔冲洗液，分滴于2片载玻片上，每片0.2 ml。将载玻片放在垫有湿纱布的搪瓷盘中，置37℃温箱中孵育30 min，取出载玻片，用生理盐水漂洗除去未贴片的细胞，晾干，瑞特氏染液染色，显微镜下观察，每片计数100个巨噬细胞，按下式计算吞噬率（%）和吞噬指数。吞噬率（%）=吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数/100个巨噬细胞×100%；吞噬指数=被吞噬的鸡红细胞数/100个巨噬细胞。结果见表5。

表5 复方白花蛇舌草胶囊对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响 （±s）

表5 复方白花蛇舌草胶囊对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响 （±s）

注：与空白对照组比较，①P＜0.01

组 别 n 剂量（g/kg）吞噬率（%）吞噬指数空白对照组 10 — 29.5±7.72 1.10±0.24香菇菌多糖片组 10 0.005 62.0±5.89① 1.62±0.37①复方白花蛇舌草胶囊高剂量组 10 21.2 51.0±4.16① 1.41±0.22①复方白花蛇舌草胶囊中剂量组 10 10.6 26.5±3.12 1.06±0.31复方白花蛇舌草胶囊低剂量组 10 5.3 26.0±5.65 1.17±0.28

表5结果显示：与空白对照组比较，香菇菌多糖片组和复方白花蛇舌草胶囊高剂量组的吞噬率和吞噬指数明显升高，有显著性差异（P＜0.01）；而复方白花蛇舌草中、低剂量组吞噬率和吞噬指数无明显变化。提示复方白花蛇舌草胶囊对巨噬细胞的吞噬功能有一定活化作用。

2.5 复方白花蛇舌草胶囊对H22荷瘤小鼠的抑瘤作用 选取昆明种小鼠50只，随机分成5组：H22荷瘤对照组、氟尿嘧啶组（0.02 g/kg）、复方白花蛇舌草胶囊高、中、低剂量组（剂量分别为 21.2 g/kg、10.6 g/kg、5.3 g/kg），每组10只。无菌取腹腔内传代7 d的H22肉瘤细胞，将细胞浓度调整为5×106个/ml，按每只0.2 ml接种于各组小鼠右腋皮下。接种24 h后，各用药组按20 ml/kg灌胃体积给予相应药物，H22荷瘤对照组给予蒸馏水，每天1次，连续给药7 d。末次给药后3 h，处死小鼠，剥离完整肿瘤组织，电子天平称量瘤体湿重。与H22荷瘤对照组比较，计算平均瘤重和抑瘤率，结果见表6。

表6 各组对H22荷瘤小鼠的抑瘤作用比较 （±s）

表6 各组对H22荷瘤小鼠的抑瘤作用比较 （±s）

注：与 H22荷瘤对照组比较，①P＜0.05，②P＜0.01

组 别 n 剂量（g/kg）平均瘤重（g）抑瘤率（%）H22荷瘤对照组 10 — 0.57±0.19 —氟尿嘧啶组 10 0.02 0.21±0.13② 63.16复方白花蛇舌草胶囊高剂量组 10 21.2 0.40±0.11① 29.82复方白花蛇舌草胶囊中剂量组 10 10.6 0.36±0.12① 36.84复方白花蛇舌草胶囊低剂量组 10 5.3 0.49±0.20 14.03

表6结果显示：与H22荷瘤对照组比较，氟尿嘧啶组及复方白花蛇舌草胶囊高、中剂量组的平均瘤重明显降低，有显著性差异（P＜0.05或 P＜0.01）；复方白花蛇舌草胶囊低剂量组平均瘤重有降低的趋势，但差异无显著性意义（P＞0.05）。提示复方白花蛇舌草胶囊对H22荷瘤小鼠的肿瘤生长有一定的抑制作用。

2.6 复方白花蛇舌草胶囊对S180荷瘤小鼠的抑瘤作用 选取昆明种小鼠50只，随机分成5组：S180荷瘤对照组、氟尿嘧啶组（0.02 g/kg）、复方白花蛇舌草胶囊高、中、低剂量组（剂量分别为 21.2 g/kg、10.6 g/kg、5.3 g/kg），每组10只。无菌取腹腔内传代7 d的S180肉瘤细胞，将细胞浓度调整为5×106个/ml，按每只0.2 ml接种于各组小鼠右腋皮下。接种24 h后，各用药组按20 ml/kg灌胃体积给予相应药物，S180荷瘤对照组给予蒸馏水，每天1次，连续给药7 d。末次给药后3 h，处死小鼠，剥离完整肿瘤组织，电子天平称量瘤体湿重，与S180荷瘤对照组比较，计算平均瘤重和抑瘤率，结果见表7。

表7 各组对S180荷瘤小鼠的抑瘤作用比较 （±s）

表7 各组对S180荷瘤小鼠的抑瘤作用比较 （±s）

注：与S180荷瘤对照组比较，①P＜0.01

组 别 n 剂量（g/kg）平均瘤重（g）抑瘤率（%）S180荷瘤对照组 10 — 2.26±0.97 —氟尿嘧啶组 10 0.02 1.08±0.65① 52.21复方白花蛇舌草胶囊高剂量组 10 21.2 1.96±0.93 13.27复方白花蛇舌草胶囊中剂量组 10 10.6 2.17±0.81 3.98复方白花蛇舌草胶囊低剂量组 10 5.3 1.93±0.88 14.60

表7结果显示：与S180荷瘤对照组比较，氟尿嘧啶组平均瘤重明显降低，有显著性差异（P＜0.01）；复方白花蛇舌草胶囊高、中、低剂组平均瘤重有降低的趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05），提示复方白花蛇舌草胶囊对S180荷瘤小鼠的肿瘤生长未能表现出有效抑制。

3 讨 论

复方白花蛇舌草胶囊选用白花蛇舌草、半枝莲为君药，白花蛇舌草具有清热解毒功效，现代药理学研究证实其对人肝癌、肺癌、结肠癌等癌细胞均具有抑制或诱导凋亡作用［3-5］；半枝莲可清热解毒、化瘀利尿，其提取物可抑制肺癌MCF7细胞增殖［6］，所含的槲皮素能抑制前列腺癌细胞的生存和繁殖［7］；网络药理学分析，半枝莲的活性成分对前列腺癌、乳腺癌、肝癌、肺癌、胃癌有显著作用［8］。二药联用，增强了处方药物的抗肿瘤能力。

由于中药口服后其成分常在胃肠道内受到消化液和肠道微生物作用，其有效成分并不一定与体内直接发挥作用的成分相符，而用含药血清进行药理实验更能反应中药的药理作用与有效成分的关系［9］。因此我们制备了复方白花蛇舌草胶囊含药血清，观察其在体外对肿瘤细胞的作用。

肿瘤细胞具有永生性，因此可以由一个祖先细胞增殖形成克隆，而分化成熟的细胞则不能形成。将处理后的肿瘤单细胞在软琼脂培养基中进行培养，每个有肿瘤特性的细胞就能形成克隆，因此克隆形成数反映了肿瘤细胞生存增殖能力［10］。复方白花蛇舌草胶囊含药血清能有效抑制HepG2、BEL-7402细胞的克隆形成，说明复方白花蛇舌草胶囊对体外培养的人肝癌细胞具有抑制克隆形成的能力，但对相应癌细胞增殖的抑制作用不明显。

巨噬细胞既可作为免疫调节细胞也能作为效应细胞去破坏、清除靶细胞，还可以识别肿瘤细胞并对其进行非特异性的免疫应答［11］。复方白花蛇舌草胶囊高剂量组对小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能有显著活化作用，其抗肿瘤作用可能与这一免疫调节功效有关。

本实验建立了H22荷瘤小鼠和S180荷瘤小鼠两个模型，观察复方白花蛇舌草胶囊体内抗肿瘤活性。结果显示，复方白花蛇舌草胶囊高、中剂量组的平均瘤重明显低于H22荷瘤对照组，其中中剂量组对H22荷瘤小鼠抑瘤率达36.84%，说明复方白花蛇舌草胶囊不但对体外培养的肿瘤细胞有一定的抗肿瘤作用，也能在体内抑制H22荷瘤小鼠的肿瘤生长。

由于中药制剂较少单用于抗肿瘤临床治疗，复方白花蛇舌草胶囊原处方在临床上也是用于放化疗后的辅助治疗。有研究报道，中药组方在荷瘤小鼠化疗过程中可发挥减毒增效作用［12-14］，因此，本课题组将进一步开展复方白花蛇舌草胶囊与放化疗药物联用的抗肿瘤作用研究，以为临床实践提供科学依据。