胃癌患者血清中RUNX3、P16 基因甲基化检测与化疗疗效的关系

刘 洁 彭 微 龚宗跃 徐筱红 刘 映

湖南中医药高等专科学校，湖南省株洲市 412000

胃癌是我国最为常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率逐年增加。胃癌早期症状不典型,临床发现时多数患者已到中晚期，因此化疗为治疗胃癌的主要方法之一。顺铂是胃癌化疗的常用药品，然而化疗耐药性严重阻碍了化疗效果的提高。

P16基因(CDKN2A)和RUNX3(Runt-relatedtranscriptionfactor 3)都是重要的抑癌基因，与多种肿瘤的发生、发展以及预后有密切关系。DNA异常甲基化可通过影响染色质结构以及影响抑癌基因的表达从而使肿瘤得以发生与发展。研究发现，在胃癌细胞中可通过RUNX3和P16的高甲基化使RUNX3和P16基因沉默，从而导致肿瘤细胞异常增殖[1-2]。另外研究也表明RUNX3和P16基因的失活和甲基化还和肿瘤细胞耐药密切相关[3-5]。本课题组前期以胃癌细胞和耐药细胞为研究对象，采用DNA甲基化芯片，对比分析两种细胞DNA甲基化表达谱差异，并结合甲基化特异性PCR(MS-PCR)技术验证最终筛选出与甲基化谱芯片结果一致的13种基因，RUNX3和P16基因就为其中的高甲基化基因。这些实验结果提示DNA异常高甲基化(包括RUNX3和P16基因)在胃癌顺铂耐药形成机制中可能起着重要作用。游离DNA为循环血中的核酸类物质，所有细胞内的核酸，血中游离的内源性脱氧核糖核酸和外源性DNA与RNA。血中游离DNA在肿瘤的早期诊断、治疗方案确定、疗效观察、预后评估等方面具有重要潜在价值。抽取血中游离DNA进行检测比检测组织DNA方法简便易行、创伤很小、速度快，这一技术在肿瘤防治中有巨大应用价值。本研究在课题组前期研究基础上收集株洲市中心医院胃癌患者41例化疗前和化疗后血清，抽提DNA,观察RUNX3和P16基因启动子甲基化状态的变化，及其变化与化疗疗效的关系，探讨胃癌患者血清中RUNX3和P16基因甲基化与化疗疗效是否有关，为临床发现肿瘤多药耐药提供线索，也为阐明耐药的表遗传机制奠定一定的理论基础。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集株洲市中心医院2015年9月—2017年12月经病理组织和影像学检查诊断为胃癌患者41例(男22例，女19例，年龄45～72岁，中位年龄58岁)。临床分期为ⅡA期5例，ⅡB期14例，ⅢA期20例，ⅢB期2例。41例组织学类型确诊为胃腺癌。术前均未接受过放化疗及细胞分子靶向治疗等任何治疗。41例胃癌患者手术后进行顺铂+5-FU化疗。在取得患者的知情同意后，采集患者化疗前、后的外周血。化疗方案每2周重复1次，化疗6个周期后进行疗效评估。20名健康献血者的血标本作为对照。

1.2 方法

1.2.1 血清标本的处理：41例胃癌患者化疗前清晨空腹时抽取外周静脉血5ml,化疗6个周期后再次抽取，抽取后血清促凝管收集, 4℃下3 000g离心10min，留取血清2ml，放入-80℃保存备用。

1.2.2 血清总DNA的提取：采用DNA提取试剂盒(购于美国Promego公司)提取血清DNA。每份标本用500μl的血清，严格按照提取说明书进行操作，DNA提取后在-80℃保存。

1.2.3 DNA亚硫酸氢钠修饰：取3μg DNA 样品，溶于60μl水中，95℃ 水浴10min，立即放于冰浴；加入 60μl 10M氢氧化钠，加入亚硫酸氢钠修饰液690μl，混匀后分装到6个PCR管，每管约130μl；将3个PCR管放入PCR仪，运用下列程序进行亚硫酸氢钠修饰反应(95℃20s，95℃10s，58℃20min，循环7次)，保存在4℃。

1.2.4 MS-PCR：使用 MethylPrimer Express 1.0 软件设计RUNX3和P16基因甲基化和非甲基化上、下游引物，引物序列、目的片段大小，引物由上海康成生物技术有限公司合成。PCR检测，反应条件：95℃热启动5min;然后95℃ 45s,60℃ 45s,72℃ 40s,共40个循环;最后72℃延伸10min。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳后观察结果。

1.3 疗效评估标准 化疗疗效按照WHO制定的实体瘤客观疗效评定标准分为完全缓解(CR)、部分缓解(PR)、疾病稳定(SD)、疾病进展(PD)。疾病总有效率RR为(CR+PR)%，CR或PR患者4周后复查CT、进行疗效确认。

1.4 统计学方法 用SPSS15.0统计软件进行处理，数据中样本率的比较采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 化疗前血清中RUNX3和P16基因甲基化检测结果 对41例胃癌患者手术后化疗前血清进行RUNX3和P16基因甲基化检测，发现41例血清中RUNX3和P16基因启动子区甲基化率分别为70.7%(29/41)和68.3%(28/41)，而20例健康献血者未检出基因甲基化，与胃癌患者外周血甲基化率差异有统计学意义(P<0.01)， RUNX3和P16基因联合甲基化检出率为75.6%(31/41)，比单项指标检出率高。

2.2 化疗前、后血清中RUNX3和P16基因甲基化表达变化 对41例患者抽取了化疗前后2次血清进行比较，结果表明41例化疗后血浆血清中RUNX3和P16基因甲基化率比化疗前降低，RUNX3基因甲基化率差异无统计学意义，而P16甲基化率差异有统计学意义(P<0.05)。见图1和表1。

A B

图1化疗前后RUNX3、P16产物琼脂糖电泳图

注：图A：化疗前；图B：化疗后。M:甲基化 PCR 条带;U:非甲基化PCR条带。

表141例胃癌患者化疗前、后血清中RUNX3、P16基因甲基化率分析(%)

2.3 血清中RUNX3和P16基因甲基化率与化疗药物疗效的关系 应用顺铂+5-FU化疗方案对41例胃癌患者进行6个周期化疗。化疗后对41例患者进行疗效评估，RUNX3启动子甲基化阳性患者化疗后的疾病总有效率RR为(CR+PR)%为37.9%，而RUNX3启动子甲基化阴性患者化疗后的疾病有效率为75.0%，差异具有统计学意义(P<0.05)；P16启动子甲基化阳性患者化疗后的疾病总有效率RR为(CR+PR)%为39.3%，而P16启动子甲基化阴性患者化疗后的疾病有效率为76.9%，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2血清中RUNX3基因甲基化率与化疗药物疗效的关系[n(%)]

3 讨论

近年来胃癌的发病率和死亡率逐年增加，化疗是治疗胃癌的最主要手段之一，然而对化疗的耐药性使胃癌化疗的疗效大大降低。肿瘤细胞的耐药机制到目前为止尚未完全清楚，因此如何提高肿瘤对化疗药物的敏感性，增加化疗疗效成为迫切需要解决的问题。

RUNX3和P16基因都为常见抑癌基因，研究表明在多种肿瘤(包括胃癌细胞)中RUNX 3和P16基因表达下调或沉默，从而导致肿瘤异常增生，其中DNA甲基化是这两种基因失活的重要机制[1-2，6-7]。DNA异常甲基化可通过影响染色质结构及影响抑癌基因的表达从而使肿瘤得以发生与发展。多数肿瘤中存在抑癌基因高甲基化的情况，这与化疗耐药的形成关系密切。许多研究报道肿瘤去甲基化后可恢复肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，逆转肿瘤对化疗药物耐药性，预测肿瘤化疗效果及预后[8-16]。我们前期工作证实胃癌癌细胞发生顺铂耐药时，细胞基因组存在广泛的DNA甲基化修饰改变(包括RUNX3和P16基因)。有研究已发现RUNX3和P16基因的甲基化和肿瘤细胞耐药密切相关，可能影响肿瘤细胞对化疗药物的敏感性[3-5，17]。但甲基化在化疗耐药中的机制尚未完全明确。

本实验表明，RUNX3和P16基因异常甲基化在胃癌患者血清DNA中可以检测到，且二者联合检测可提高检出率，而正常献血者未检出基因甲基化，说明RUNX3和P16基因甲基化与胃癌的发生发展有关。而另一方面研究发现胃癌患者化疗后血浆血清中RUNX3和P16基因甲基化率比化疗前降低，虽然RUNX3基因甲基化率化疗前后差异无统计学意义(可能和标本量太少有一定关系)，但RUNX3和P16基因甲基化阳性组的化疗总有效率要低于阴性组，且差异具有统计学意义。提示RUNX3和P16基因甲基化可能与胃癌化疗疗效存在相关性，在化疗药物耐药中起到非常重要的作用，但其具体的耐药分子机制有待进一步研究。