五味沙棘泡腾片的提取工艺考察

杨 静 阿古拉

内蒙古医科大学药学院，内蒙古 呼和浩特 010100

五味沙棘方是蒙藏医临床常用的传统方药之一，全方由沙棘膏、木香、白葡萄干、甘草、栀子5味药组成, 沙棘膏为方中君药,含多种黄酮化合物,主要有异鼠李素、异鼠李素-3-β-D-葡萄糖苷、异鼠李素-3-β-D-芸香糖苷、槲皮素、山奈素。方中以味酸,性温,锐而有止咳、祛痰、除巴达干功效的沙棘膏为主;以排脓、祛痰的木香为辅,配以白葡萄干以清肺热、止咳、平喘,甘草以清热,止咳、祛痰,栀子以清血热为之佐使。功能主治清热祛痰、止咳定喘,临床用于肺热久咳、喘促痰多、胸中满闷等。现行2015年版《中国药典》一部收载有五味沙棘散,且其质量标准较为完善[1]，市场上已有五味沙棘颗粒、五味沙棘含片及五味沙棘口服液等，但有关泡腾片质量标准的研究尚未见报道。鉴于此将其制成迅速溶解，吸收迅速，便于患者服用的口服泡腾片剂型。蒙藏医临床常用的传统方药，采用水平正交试验法，以方中君药沙棘膏中槲皮素、山柰素、异鼠李素的总量作为提取工艺的评价指标，来优化提取工艺。

1 仪器与试药

岛津LC-20A型高效液相色谱仪(SPD-M20A二极管阵列检测器、CBM-20A型控制器、CTO-20A柱温箱、LC-20AT型输液泵、SIL-20A型自动进样器、LC solution色谱数据工作站、DGU-20A5型脱气机)，电子分析天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)，旋转蒸发仪(瑞士步琦有限公司)，HH-D4型数控恒温水浴锅(金坛市双捷实验仪器厂)，甲醇、磷酸(天津市盛奥化学试剂有限公司)、乙醇(国药集团化学试剂有限公司)，色谱甲醇(SIGMA-ALDRICH),水为超纯水，槲皮素、山柰素、异鼠李素(中国食品药品检定研究院)，中药材(内蒙古天力药业有限公司)

2 方法与结果

2.1 正交试验优选提取工艺条件 由于处方中多数药材的已知有效成分在乙醇中具有较好的溶解性[2-6]。故采用单因素考察后，选用L9(34)水平正交试验，以槲皮素、山柰素和异鼠李素含量对工艺进行优化，所确定的正交因素水平见表1。

表1 正交试验因素水平

2.2 槲皮素、山柰素和异鼠李素的含量测定

2.2.1 色谱条件 采用Agilent C18色谱柱(250mm×4.6mm),5 μm;流动相为甲醇：0.4%磷酸水溶液(65∶35)，流速1 mL·min-1，柱温35℃，检测波长370 nm，进样10 μL。

2.2.2 供试品溶液 取五味沙棘方中除木香外的其余四味药,精密称定, 置圆底烧瓶中, 精密加入8倍量的75%乙醇, 加热回流l h,提取2次, 滤过放冷, 用旋转蒸馏仪回收乙醇后将药液定容于100 mL容量瓶中备用。精密量取25 mL，置具塞锥形瓶中, 加盐酸3.5 mL， 加热回流水解1 h, 立即冷却, 移至50 mL量瓶中, 用适量75%乙醇洗涤容器,洗液并入同一量瓶中,加75%乙醇至刻度,摇匀,滤过,即得。

2.2.3 对照品溶液的制备 精密称取槲皮素3.559 mg、山柰素2.534 mg、异鼠李素3.021 mg分别置于100 mL、100 mL、10 mL容量瓶中用甲醇溶解并定容，摇匀，滤过，即得对照品溶液

2.2.4 阴性对照试验 阴性对照提取液(处方中缺沙棘膏药材),按提取物测定液的制备方法制备供试液,进样测定。结果表明其色谱在槲皮素、山柰素、异鼠李素相应保留时间无峰，如图1所示。说明处方中其他成分对测定结果无干扰。

2.2.5 线性关系考察 精密吸取“2.2.3”节下混合对照品溶液1、2、5、10、15、20 μL，注入高效液相色谱仪，按“2.2.1”节下色谱条件进行测定，以进样量对峰面积积分值进行回归分析，所得结果见表2，3种黄酮在所测定范围内呈良好的线性关系。

表2 3种黄酮线性关系

2.2.6 精密度试验 精密吸取标准品溶液10 μL进样,按2.2.1项下重复进样6次,测得槲皮素、山柰素和异鼠李素的峰面积积分值,计算RSD分别为0.65%、0.74%、0.86%。表明方法精密度良好。

2.2.7 稳定性试验 取提取液测定液，按0、2、4、6、8 h不同时间间隔进样，测得槲皮素、山柰素和异鼠李素的峰面积积分值，计算RSD分别为1.03%、1.15%、1.52%，结果表明提取物测定液中槲皮素、山柰素和异鼠李素在8 h内稳定。

2.2.8 重复性试验 分别称取样品5份，按供试品溶液制备方法平行制备5份溶液，进样10 μL，测定峰面积，连续进样2次，计算槲皮素、山柰素、异鼠李素含量的RSD分别为0.77%、0.57%、0.77%。结果表明本方法重复性良好。

2.2.9 回收率试验 精密称取已测知含量的五味沙棘提取物的样品,分别加入不同质量的槲皮素(见表3)山柰素(见表4)异鼠李素(见表5)对照品,按样品溶液的制备方法制备样品,测定其含量,计算回收率。

表3 槲皮素对照品

表4 山柰素对照品

表5 异鼠李素对照品

2.10 提取物含量测定 精密吸取正交试验各试验号提取液测定液10 μL,按上述色谱条件依次进样,测定槲皮素、山柰素、异鼠李素峰面积积分值如图1所示；经计算槲皮素、山柰素、异鼠李素的含量见表6。

2.3 试验结果分析 采用综合平衡法对试验结果进行极差分析和方差分析(SPSS统计软件),结果见表6、表7。由表6中的R值可知，以槲皮素、山柰素、异鼠李素的总含量为指标时，影响因素的大小顺序均为A>C>D>B。说明溶剂浓度和提取时间是重要因素，提取次数和溶剂倍数次之。由方差分析结果可知，因素A、C对总含量的影响均有显著性。结合极差分析，并按生产实际中降低消耗，提高效率的原则，确定五味沙棘泡腾片较优的提取工艺条件为A2B3C1D2，即加入75%乙醇8倍量，提取2次，每次1 h。

表7 主旨间效果检定 因变数: VAR00001

注：a.R2=0 .870(调整的R2=0.755)。

2.4 提取工艺的验证 按上述较优的工艺进行试验验证(n=6)，结合槲皮素、山柰素、异鼠李素总含量的平均值为3.6300 mg/g，表明所确定的较优工艺合理可行。

3 讨论

考虑到槲皮素、山柰素、异鼠李素的化学性质，在进行提取工艺条件的考察时，采用了65%乙醇、75%乙醇、85%乙醇 、95%乙醇作为溶媒进行回流提取。结果表明，75%乙醇较优，考虑到浓度为影响因素，故以70%、75%、80%为提取溶剂浓度进行正交试验考察。根据文献报道沙棘膏中黄酮类化合物大多数以糖苷的形式存在，主要以槲皮素苷、山柰素苷、异鼠李素苷。如果直接测槲皮素、山柰素、异鼠李素的含量发现及其低，难以反映黄酮类化合物的真实含量，因此试验中采取酸水解后测定槲皮素、山柰素、异鼠李素的含量。为了尽可能短时间内获得较好的分离效果，对色谱条件进行优化，考察了不同组成的流动相，如乙腈—水、甲醇—水、甲醇—酸系统，酸比较了磷酸和冰醋酸。结果表明磷酸可以减少色谱峰拖尾，使色谱峰达到较高的对称性，改善了分离度，最终确定下条件为甲醇—0.4%磷酸水溶液为流动相，峰形对称，无拖尾现象，槲皮素保留时间为14 min左右，山柰素保留时间为23 min左右，异鼠李素保留时间在27 min左右。

4 小结

在五味沙棘泡腾片的研制过程中,根据方中各味药材中主要有效部位或有效成分的理化性质,确实了五味沙棘泡腾片的工艺路线。采用正交试验法对醇提工艺进行优化，以槲皮素、山柰素和异鼠李素的总量为指标，优选了最佳煎煮工艺条件。通过剂型改进，对全粉末的五味沙棘散中全部药材进行了提取，减少了服药量，有助于有效部位或有效成分的溶出和吸收，加快了药品的起效速度，同时便于服用、携带和贮藏，为患者提供了一种全新的给药选择方案。

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