金连菊复方制剂对大鼠的亚慢性毒性试验

兰宗宝,俸祥仁,张 鑫,何莫斌,陈德元,罗 丽,陈 燕

(1.广西农业科学院 农业科技信息研究所,广西 南宁 530007;2.广西南宁强微农牧科技有限公司,广西 南宁 530001;3.广西百朋种畜场,广西 柳州 541502)

随着我国养猪产业的不断发展,养猪场规模不断扩大,猪病也日趋复杂,致使猪场乱用、滥用化学抗生素的现象频繁发生,不仅容易诱发病原菌的耐药性及造成生态环境污染,还会导致猪肉药物残留,严重影响我国食品安全及危害人体健康[1]。为此,国家层面先后制订发布了《食品动物禁用的兽药及其他化合物清单》、《药物饲料添加剂使用规范》、《动物性食品中兽药最高残留限量》等法规制度,以期进一步规范抗生素在养猪行业中的使用准则。中药具有天然的保健及药用成分,可提高机体的免疫力,同时具有抗病毒及抗应激等活性作用[2,3],且毒副作用小,不易诱发病原菌产生耐药性,目前在畜禽养殖业中已得到广泛应用[4]。中药复方制剂是由两种或两种以上的中药材组方而成,其有效成分复杂且多不明确,因此需通过毒理学试验检验组方药物间的配伍效果,以减少或避免药物在临床应用时产生拮抗作用等不良反应[5]。本课题组前期研究发现,金银花、连翘、野菊花、乌梅和五倍子等中药对大肠杆菌、巴氏杆菌、链球菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和放线杆菌等6种猪场常见病原菌均表现为高度敏感,对应的最小抑菌浓度(MIC)较低[6],在此基础上研发出了金连菊复方制剂(金银花15 g,连翘25 g,野菊花25 g,乌梅15 g,五倍子20 g)。根据新兽药临床前研究阶段要求,需采用实验动物开展相关安全性试验以考察产品开发的可行性及验证药物的安全性。因此,我们以Wistar大鼠为动物模型开展了金连菊复方制剂的亚慢性毒性试验,旨在评价其用药安全性,为金连菊复方制剂的兽医临床用药提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

金连菊复方制剂的中药原材料(金银花、连翘、野菊花、乌梅和五倍子)购自广西玉林市中药材专业市场。Wistar大鼠(雌、雄各半)购自广西医科大学实验动物中心,共100只,体重80～120 g/只。在试验期间饲喂大鼠全价饲料,室温控制在18～22 ℃,相对湿度为40.0%～70.0%。本试验所用的主要仪器设备有体视显微镜、手提式压力蒸汽消毒器、生化无菌培养箱、血细胞分析仪、生化分析仪和尿液分析仪等。

1.2 试验方法

1.2.1 中药材处理 按组方配比精确称取乌梅、连翘、五倍子和野菊花总量500.0 g,在煎煮前以5～7倍蒸馏水浸泡1～2 h,煎煮30 min后收集药液；再加入3～5倍蒸馏水，继续煎煮30 min；合并两次药液，浓缩至生药含量为1.0 g/mL；以4000 r/min离心20 min,收集上清液装瓶备用。用95%乙醇浸泡金银花6～8 h,收集浸提液；药渣再用95%乙醇浸泡4～6 h；合并两次浸提液，在80 ℃下加热回流1.5～2.0 h,收集浸提液,过滤,浓缩至生药含量1.0 g/mL,装瓶备用。按85∶15的比例合并上述两种药液,以手提式压力蒸汽消毒器灭菌30 min,即获得金连菊复方制剂。在试验前浓缩或稀释至设计的用药浓度。

1.2.2 试验分组及给药 对Wistar大鼠先进行适应性饲养1周,然后随机分5组,每组20只,雌、雄各半。其中4组为给药剂量组(Ⅰ～Ⅳ组),分别经口灌服不同浓度(0.5、1.0、2.0和5.0 g/mL)的金连菊复方制剂,每只Wistar大鼠每天灌服一次,按每100 g体重灌服1.5 mL的剂量给药;对照组(CK)灌服蒸馏水。连续给药90 d,在试验期间每日观察并记录大鼠的活动、进食及饮水情况,每周称重一次。

1.2.3 测定指标及方法 停药后第2天对所有Wistar大鼠进行眼球采血,将每只Wistar大鼠的血样分成2份:一份以抗凝剂抗凝,用于血常规指标检测;另一份静置析出血清,用于检测血清生化指标。完成采血工作后,每组随机选取10只Wistar大鼠进行剖检,称取心脏、肝脏、脾脏、甲状腺、肾脏等主要器官的重量,计算各器官的脏器系数;同时采集心脏、肝脏、脾脏、肾脏、胃、肠道等器官组织进行固定和制作石蜡切片,用于组织病理学检测。

1.3 统计分析

对试验数据采用Excel 2007进行整理,用DPS进行单因素方差分析,并以Duncan’s新复极差法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 金连菊复方制剂对Wistar大鼠体重增长的影响

在整个试验周期内,各给药剂量组Wistar大鼠未见死亡和明显的中毒症状,生长活动基本正常。由表1可知：在试验0～8周期间各给药剂量组Wistar大鼠的体重增长幅度与CK无显著差异,且均表现为雄性Wistar大鼠的体重增长幅度大于雌性Wistar大鼠。从第9周开始,Ⅳ组雄性Wistar大鼠的体重增长幅度明显降低,其中,第9周的增重与CK相比差异显著(P<0.05),第10～13周的增重与CK相比差异极显著(P<0.01);Ⅳ组雌性Wistar大鼠从第10周开始其体重增长幅度也明显降低,与CK相比差异极显著;而Ⅲ组雄性Wistar大鼠的体重增长幅度从第11周起显著低于CK。

2.2 金连菊复方制剂对Wistar大鼠脏器系数的影响

试验结束时剖检发现：Ⅳ组Wistar大鼠的心脏、甲状腺和肾脏增大,其中,心脏系数与CK相比呈显著增加趋势,甲状腺和肾脏的脏器系数与CK相比差异极显著;而Ⅰ～Ⅲ组Wistar大鼠心脏、肝脏、脾脏、甲状腺和肾脏的脏器系数与CK相比差异均不显著(表2)。

2.3 金连菊复方制剂对Wistar大鼠血常规指标的影响

由表3可知：Ⅲ组Wistar大鼠的血小板数较CK显著下降，但其红细胞压积较CK极显著上升；Ⅳ组Wistar大鼠的血小板数及血小板压积均较CK极显著下降,但其指标值均在正常范围内;Ⅰ～Ⅱ组Wistar大鼠的各项血常规指标与CK间差异均不显著。说明金连菊复方制剂对Wistar大鼠的血常规指标基本上无明显影响。

表1 金连菊复方制剂对Wistar大鼠体重增长的影响 g/只

注:“*”或“**”分别表示与CK相比差异显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)。表2～表4与此相同。

表2 金连菊复方制剂对Wistar大鼠脏器系数的影响

表3 金连菊复方制剂对Wistar大鼠血常规指标的影响

2.4 金连菊复方制剂对Wistar大鼠血清生化指标的影响

由表4可知：Ⅳ组Wistar大鼠的血糖含量和碱性磷酸酶活性显著低于CK,而其尿素氮和肌酐含量极显著高于CK;Ⅰ～Ⅲ组Wistar大鼠的各项血清生化指标与CK间差异均不显著。说明0.5～2.0 g/mL的金连菊复方制剂对Wistar大鼠的血清生化指标无明显影响。

表4 金连菊复方制剂对Wistar大鼠血清生化指标的影响

2.5 组织病理学检查结果

在亚慢性毒性试验结束后剖检观察,发现不同处理组Wistar大鼠的器官组织均未见任何异常和可疑病理变化。采集CK和Ⅳ组Wistar大鼠的心脏、肝脏、脾脏、肾脏、胃、肠道等器官组织制作石蜡切片,仅发现Ⅳ组Wistar大鼠的肾脏略有变化,其肾小囊间隙增大,但其他器官组织均未观察到异常病理变化(图1)。上述结果表明金连菊复方制剂对Wistar大鼠脏器组织无损害作用。

图1 CK和Ⅳ组Wistar大鼠的脏器组织石蜡切片观察结果

3 讨论

中药复方是中医用药的主要形式,是基于辩证的思想观点,按照“君—臣—佐—使”的组方原则,选择恰当的药物定量配伍而成[7]。与单方药物相比,复方制剂具有改善服用药品依从性、提高药物疗效、减少不良反应、降低用药费用等优点[5],目前在畜禽养殖生产上已得到广泛应用。丁俊仁等[8]针对新生仔猪腹泻病,以党参、金银花、干姜、半夏、藿香、甘草、茯苓等研制出参金口服液;吴苑滢等[9]以鱼腥草、桔梗、陈皮、茯苓等为原料研发出鱼腥草桔苓合剂,并证实该合剂对Wistar大鼠无慢性毒性作用,安全性好;肖蕊等[10]在桂柴方剂的基础上研发出针对鸡风寒感冒的桂柴感寒口服液;邓鑫等[5]以广西地道药材苦玄参和桃金娘根为主要药味，制备获得了复方苦玄参颗粒,该颗粒具有清热泻火、消炎止痢的功效。本研究中的金连菊复方制剂是依据金银花、连翘、野菊花、乌梅和五倍子等5味中药对大肠杆菌、巴氏杆菌、链球菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和放线杆菌等6种猪场常见病原菌高度敏感而研发获得的,以期作为饲料添加剂应用于断奶仔猪的育肥养殖。

中药复方制剂是否安全是进一步研究其药理、毒理作用的基本保障,同时对评价新药是否具备研发价值具有重要意义,即开展急性毒性试验和亚慢性毒性试验是评价中药复方制剂安全性的必要环节[11]。其中,亚慢性毒性试验是通过不同剂量的长期重复给药,观察不同剂量药物长期在动物体内可能发生的不良反应,从而判断药物对靶器官和受试动物的累积作用,并明确安全的可重复给药剂量值区间,为临床科学用药提供理论依据[12]。本研究以金连菊复方制剂连续灌服Wistar大鼠90 d,是常规亚慢性毒性试验周期(30 d)的3倍,以期更好地揭示该药物的亚慢性毒性作用。结果表明,各剂量组Wistar大鼠除个别检测指标较CK呈显著或极显著升高或降低变化外,整体上其体重增长速率、脏器系数、血常规指标、血清生化指标及主要脏器组织结构与CK相比无明显变化,说明长期服用金连菊复方制剂对Wistar大鼠无亚慢性毒性作用,安全性好。但金连菊复方制剂作为饲料添加剂应用于断奶仔猪育肥养殖的给药剂量尚需进一步研究确认。