蒙医不同针刺法对抑郁大鼠前额叶单胺类神经递质及PKA/CREB/BDNF通路的影响

艾丽雅 杨利娟 刘俊彤 敖其尔 赛音朝克图

[摘要] 目的 观察蒙医不同针刺法对抑郁大鼠前额叶神经递质及蛋白激酶（PKA）活性、环磷腺苷效应元件结合蛋白（CREB）磷酸化和脑源性神经营养因子（BDNF）表达，探究蒙医不同针法的抗抑郁作用机制。 方法 将40只雄性Sprague-Dawley大鼠按照随机数字表法分为空白组、模型组、蒙医银针组、蒙医三根平衡针组和药物组，每组8只。除空白组外其他组大鼠孤养并给予不可预知的7种不同的应激刺激28 d。其中空白组每笼饲养4只，正常饮水摄食，不给任何刺激;模型组不给予任何治疗;蒙医银针组于每日接受应激刺激前1 h，进行蒙医银针刺激巴达干穴、心穴和黑白际穴;蒙医三根平衡针组的针刺和选穴同蒙医银针组，但每日选取1个穴位给予温针刺激;药物组于每日进行应激刺激前1 h，将盐酸氟西汀以0.9%氯化钠溶液配制成1 mg/mL，按照2 mg/kg体重，灌胃给药。28 d后断头，取大鼠前额叶，采用酶联免疫吸附法和Western blot法检测5-羟色胺（5-HT）、去甲肾上腺素（NE）、多巴胺（DA）含量，PKA活性，CREB磷酸化和BDNF表达水平。 结果 与空白组比较，造模28 d后模型组大鼠前额叶5-HT、NE、DA含量显著降低（P < 0.01），PKA活性、CREB和BDNF表达水平也明显下降（P < 0.05）。与模型组比较，蒙医三根平衡针组、药物组大鼠前额叶NE、DA和5-HT的含量明显升高，差异有统计学意义（P < 0.05），蒙医银针组大鼠前额叶DA和5-HT的含量明显升高，差异有统计学意义（P < 0.05）。与模型组比较，蒙医银针组、蒙医三根平衡针组和药物组大鼠前额PKA活性、CREB和BDNF表达水平显著升高，差异有统计学意义（P < 0.05）。 结论 蒙医不同针法能有效提高5-HT、NE、DA含量、PKA活性及CREB-BDNF的表达，提示蒙医不同针法均有抗抑郁作用。

[关键词] 蒙医;针刺;抑郁症;单胺类神经递质;PKA/CREB/BDNF通路

[中图分类号] R749.4;R245          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2019）03（b）-0009-05

抑郁症是以持续的情绪低落为主要特征的精神障碍。目前对于抑郁症的发病机制尚不完全明了。很多研究数据显示，单胺类神经递质在脑内的含量水平与抑郁症的发病密切相关[1-2]。脑源性神经营养因子（BDNF）参与促进神经元发育、分化、再生等一系列生物学效应[3]。在抑郁动物模型中，大脑海马和前额叶皮质内环磷腺苷效应元件结合蛋白（CREB）和BDNF表达异常[4]。而且抑郁症患者BDNF水平与汉密尔顿抑郁量表（HAMD）得分呈负相关[5]。BDNF能促进5-羟色胺（5-HT）、多巴胺（DA）能神经元的再生和发芽，促进前额叶、海马神经元的生成[6]。因此，本研究观察蒙医不同针刺法对抑郁模型大鼠前额叶蛋白激酶A（PKA）活性、CREB磷酸化、BDNF表达及5-HT、去甲肾上腺素（NE）、DA含量的影响，探究蒙医不同针法的抗抑郁作用机制，同时可进一步阐释PKA/CREB/BDNF信号通路在抑郁症发病机制中的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

选取清洁级Sprague-Dawley雄性大鼠40只，1.5～2.0月龄，体重（220±10）g，北京维通利华实验动物技术有限公司提供，合格证号：SYXX（京）2012-0001，于北京中医药大学实验动物中心饲养，所有实验均在屏障系统下进行。大鼠可自由进水和进食以适应环境，饲养7 d，而后测量体重，同时采用开野试验、糖水试验等进行行为学检测，通过开野试验剔除过于活跃和安静的大鼠，留下适合条件的40只大鼠，并将其按照随机数字表法分为五组（空白组、模型组、蒙医银针组、蒙医三根平衡针组和药物组），每组8只。

1.2 仪器与试剂

1.2.1 仪器  电泳仪（美国Bio-Rad公司）;水平脱色摇床（江苏其林贝尔公司）;ABI7500荧光定量PCR（Applied Biosystems公司）;蒙医RZ-Ⅰ型电热银针治疗仪（内蒙古元阳中蒙医科技开发有限公司）;温冷冻离心机及MultiSkan3酶标仪均购于美国Thermo公司。

1.2.2 试剂  盐酸氟西汀胶囊（百忧解，20 mg×28粒，礼来苏州制药有限公司）;5-HT（美国Sigma公司，批号：114K7028）;DA、NE（中国食品药品检定研究院，批号：100070-201006、100169-21103）;CREB抗体（美国CST公司）;BDNF抗体（美国Santa公司）;山羊抗兔IgG和山羊抗小鼠IgG（北京天德悦公司）;β-actin鼠单抗（美国Immunoway公司）。

1.3 造模与干预方法

1.3.1 造模方法  依照文献[7-8]，造模大鼠全部孤养，并且在28 d内随机进行4℃冷水游泳5 min、昼夜颠倒24 h、禁食24 h、禁水24 h、夹尾3 min、水平摇晃30 min、潮濕环境24 h等7种不同应激刺激。每天进行1种刺激，但同一种刺激不可连续重复出现，每种刺激最少可进行3次。经过28 d造模后通过行为学（开野试验、糖水试验）及体重检测证明慢性应激抑郁模型大鼠造模成功。

1.3.2 干预方法  空白组大鼠合笼饲养，其他各组大鼠均孤养。空白组：正常饮水摄食，不给予任何刺激。模型组：接受7种不同的应激刺激。蒙医银针组：每天接受应激刺激前1 h，进行蒙医银针（银针长度3 cm、直径0.65 mm）刺激巴达干穴、心穴、黑白际穴。每次留针时间为20 min，并且针刺时巴达干穴、心穴针尖向上斜刺0.8 cm，黑白际穴针尖向下斜刺0.8 cm。蒙医三根平衡针组：针刺和选穴同蒙医银针组，但每日取1个穴位，并且针柄连接蒙医RZ-Ⅰ型电热银针治疗仪加温刺激（温度40～42℃），每次加温20 min。以第1天巴达干穴、第2天心穴、第3天黑白际穴为加温循序依次循环刺激。药物组：在每天接受应激刺激前1 h，把盐酸氟西汀（百忧解）以0.9%氯化钠溶液配制成1 mg/mL，按2 mg/kg体重灌胃给药。每组干预方法都进行28 d。注：巴达干穴位于第三胸椎下凹正中，心穴位于第7胸椎下凹正中，黑白际穴位于前正中线，两乳正中的心窝处。

1.4 觀察指标

行为学检测全部完成后对大鼠进行开胸腔，暴露心脏，先用0.9%氯化钠溶液灌流10 min，而后用4%甲醛急灌10 min，慢灌20 min。断头取脑，除去颅骨，在冰袋上迅速取出海马，取下额叶，称重，放置速冻管，液氮速冻，并保存于-80℃超低温冰箱待测。上述操作均在冰盘上3 min内完成。利用酶联免疫吸附法按照试剂盒操作说明测试前额叶5-HT、DA、NE表达水平，利用Western blot法检测PKA活性、CREB和BDNF表达水平。用BCA法提取组织蛋白，以β-actin（分子量为42 kD）作为内参照，用Total Lab Quant软件图像分析。

1.5 统计学方法

采用SPSS 19.0统计软件分析数据，所有检测数据以均数±标准差（x±s）表示。若各组数据服从正态分布，且数据方差齐，则采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验;若数据非正态分布或方差不齐，可采用非参数检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 蒙医不同针法对抑郁大鼠前额叶皮质5-HT、DA、NE含量的影响

与空白组比较，模型组大鼠前额叶NE、DA和5-HT含量显著降低（P < 0.01）;与模型组比较，蒙医三根平衡针组、药物组大鼠前额叶NE、DA和5-HT的含量明显升高，差异有统计学意义（P < 0.05）;与模型组比较，蒙医银针组大鼠前额叶DA和5-HT的含量明显升高，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表1。

2.2 各组大鼠前额叶PKA活性、CREB和BDNF表达水平比较

2.2.1 蒙医不同针法对抑郁大鼠前额叶PKA活性的影响  Western blot结果显示，与空白组比较，模型大鼠前额叶PKA活性明显降低（P < 0.01）;与模型组比较，蒙医银针组、蒙医三根平衡针组、药物组大鼠前额叶PKA活性显著升高（P < 0.05）。

2.2.2 蒙医不同针法对大鼠前额叶CREB和BDNF表达的影响  Western blot检测显示，与空白组比较，模型组大鼠前额叶CREB和BDNF表达降低（P < 0.01）;与模型组比较，蒙医银针组、蒙医三根平衡针组、药物组大鼠前额叶CREB和BDNF表达上升（P < 0.05）。

3 讨论

慢性不可预知应激模型是抗抑郁药物评价应用最广泛的模型。在前期研究工作中发现，给予慢性应激刺激后模型组大鼠活动减少，探索兴趣降低[9]，证明造模成功。

单胺类神经递质失衡假说在抑郁症治疗和发病机制研究中起重要作用[10]。本研究结果显示，与空白组比较，模型组大鼠额叶5-HT、NE、DA含量明显降低（P < 0.01），蒙医不同针刺法均能提高抑郁大鼠额叶5-HT、NE、DA含量。证实了脑内神经递质转运失衡与抑郁发生密切相关的假说。多项研究显示，CREB-BDNF通路广泛参与抑郁症的发生。CREB是一种转录因子，其在蛋白家族激活后主要的功能是调节基因转录[11-12]。cAMP通过PKA使其下游靶标CREB的Ser133点位发生磷酸化[13]，磷酸化的CREB与细胞核内的环磷酸腺苷反应元件结合因子特异性结合后诱导相应的基因表达[14]。BDNF是CREB的经典下游靶基因[15]，cAMP通过激活PKA，使CREB磷酸化，从而促进BDNF基因表达[16-17]。抑郁症患者海马、前额叶和血清BDNF含量明显下降，给予抗抑郁药物治疗能够增加BDNF的表达[18-19]。

本研究结果显示，给予慢性应激刺激28 d后PKA活性及CREB和BDNF表达明显下降。蒙医银针组、蒙医三根平衡针组和药物组的PKA活性及CREB和BDNF表达水平均高于模型组。提示慢性应激抑制PKA活性及CREB和BDNF的表达，抗抑郁治疗能够改善PKA活性以及CREB和BDNF的表达。提示蒙医不同的抗抑郁针刺法均对PKA的激活、CREB和BDNF基因表达具有明显的促进作用。

研究表明，5-HT神经传递和BDNF水平都可以增加抑郁易感性[20]。BDNF能促使5-HT神经元的存活以及分化，5-HT转运也可刺激BDNF的表达[21]。但是由于促进5-HT/NE/DA膜转运途径的相关调控分子比较复杂，而且抑郁的发生依赖于基因、心理、环境等多种复杂因素的交互作用，而不是单一、简单清晰的发病机制，BDNF以外的其他基因也有可能参与调节5-HT系统的失衡。故5-HT/NE/DA系统和BDNF信号通路对抑郁症的调节作用和生理功能所产生的影响仍待进一步研究。

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（收稿日期：2018-08-15  本文編辑：张瑜杰）