加热法破坏IgM在孕妇免疫血清学检测中的应用

楼菊蓉

【摘 要】目的：探讨不同方法破坏IgM，检测孕妇IgG抗A（B）抗体效价的效果。方法：随机检测7例门诊O型Rh阳性孕妇，对每一例孕妇血清分成三份，分别采用63℃10分钟、63℃20分钟及DTT破坏血清IgM后，比较IgG抗A（B）效价的差异，并探讨63℃10分钟、63℃20分钟及DTT法的相关性。结果：水浴法不仅中和IgM抗体，。63℃20分钟与DTT法比较IgG抗A（B）效价结果存在显著差别（P<0. 05），63℃10分钟与DTT法比较IgG抗A（B）效价结果无显著差别（P>0. 05）。三种方法分离IgG结果有高度正相关。结论：63℃加热10分钟操作简单，影响因素少，没有致癌性，对身体影响小，试验时间也较DTT短，是值得运用的技术。

【关键词】孕妇免疫性抗体;水浴加热法;DTT

【中图分类号】 R715

【文献标识码】 B【文章编号】 1672-3783（2019）04-03-010-01

背景

新生儿溶血病（HDN）是发生在胎儿或新生儿的一种免疫溶血性疾病，是由母婴血型不合引起。研究证实[12]，母亲的IgG可通过胎盘上的Fc受体转运到胎儿体内。新生儿溶血病的发病几率依照孕妇IgG抗A或者抗B的抗体效价而变化，效价越高，发病几率越大，且孕妇抗体效价变化越快越早，新生儿溶血病的发病几率越大[3]血清中抗A和抗B是IgM和IgG的混合物，要测定IgG抗A和抗B抗体，需要排除IgM的干扰。然而采用二硫苏糖醇（DTT）方法破坏gM抗体是血型血清学检查中的常用技术，这种方法所需时间长，很难及时为临床提供诊断依据，国内有人报道血型血清加入生理鹽水70℃水浴30分钟破坏gM抗体完全且不影响IgG[4]，外国文献指出63度10分钟的温度能破坏IgM抗体[5]. 为了提高血清学检查的效率，探讨新方法来补充临床实验室对检测孕妇免疫性抗体。运用63℃10分钟和63℃20分钟水浴法对7例标本对比中和IgM的效果，及平行测定IgG抗A（B）效价与DTT测定结果进行比较，现报告如下。

1 材料和方法

1.1 标本来源

随机选取7例O型孕妇，Rh （D）阳性，不完全抗体筛选试验阴性为对象，。

1.2 仪器与试剂

可调节温度水浴箱、恒温水浴箱、;3% A型和B型Rh（D）阳性血球（选6～8人份配制）、0.8% 标准A、B型血球（长春博讯生物技术公司，）10mmol/lDTT（BIOSHARP公司）抗人球蛋白（抗IgG+C3d）检测卡（江苏力博生物技术公司），LB-3000医用低速离心机等。

1.3 操作与方法

1.3.1 将7例O型孕妇血清分成2份，一份用两种方法检测IgM 抗A（B）效价。①DTT检测法：取孕妇血清100ul与10mol/LDTT溶液700ul混匀，加盖37℃孵育30分钟，0.9%氯化钠溶液作倍比稀释，稀释度分别为1：16，1：32，1：64，1：128，1：256，1：512等。然后加入3%A，B型红细胞悬液各一滴，直接3000转15秒离心肉眼观察试管是否凝集。以出现凝集强度1+的最高稀释度的倒数为孕妇IgM抗A（B）效价②水浴检测法：调节水浴箱温度到63度，做2管标记，1管取100ul血清加入300ul生理盐水混匀，放63度水浴箱10分钟。另一管取100ul血清加入300ul生理盐水混匀，放63度水浴箱20分钟.后续各管用0.9%氯化钠溶液倍比稀释，稀释度分别为1：8，1：16等。然后加入3%A，B型红细胞悬液各一滴，直接3000转15秒离心肉眼观察试管是否凝集。以出现凝集强度1+的最高稀释度的倒数为孕妇IgG 抗A（B）效价

1.3.2 另一份用三种方法检测IgG 抗A（B）效价。①DTT检测法：取孕妇血清100ul与10mol/LDTT溶液700ul混匀 ，加盖37℃孵育30分钟，0.9%氯化钠溶液作倍比稀释，稀释度分别为1：16，1：32，1：64，1：128，1：256，1：512等。然后吸取25μl稀释处理好的血清，加入中抗人球蛋白（抗IgG+C3d）检测卡，再加入其标准0.8%A，B红细胞各1滴，混匀37℃孵育15min，用LB-3000离心机离心9min，结果判读。②水浴检测法：调节水浴箱温度到63度，做2管标记，1管取100ul血清加入300ul生理盐水混匀，放63度水浴箱10分钟。另一管取100ul血清加入300ul生理盐水混匀，放63度水浴箱20分钟。后续各管用0.9%氯化钠溶液倍比稀释，然后吸取25ul稀释处理好的血清，加入中抗人球蛋白（抗IgG+C3d）检测卡，再加入其0.8%标准A，B红细胞，混匀37℃孵育15min，用LB-3000离心机离心9min，结果判读

1.4 统计学处理 用Graphpad prism6统计软件，检测结果以2 为底数取指数后计算结果。P<0.05表示两组之间有显著性差异。用pearson检验做相关性分析，若P<0.05表示两组之间有显著性相关。

2 结果

2.1 三种方法中和IgM抗体结果

DTT法和63℃水浴法对IgM抗体中和效果无明显差异，63℃10min与63℃20 min破坏IgM抗体同样较彻底。遂接下来选择63℃10分钟和63℃20分钟水浴法对IgG抗体进行检测。见表1.

2.2 三种方法取得IgG效价

分别用63℃10min与63℃20min检测7例0型孕妇IgG效价，对检测结果DTT30min进行医学统计，方差齐（P<0.01），用单向方差分析检验，63℃10min与DTT30min检测效果无显著性差异（P>0.05），63℃20min与DTT30min检测效果有显著性差异（P<0.05），63℃10min检测检测IgG抗A（B）效价结果同样也准确。见表2

2.3 两种水浴法和DTT法相互关系

根据63℃10min分离血清IgGA.IgGB与DTT30min分离血清IgGA.IgGB效价之间，63℃20min分离血清IgGA.IgGB与DTT30min分离血清IgGA.IgGB效价之间，分别存在高度相关性（P <0.01），但图1中R2=0.9177与1相近，说明63℃10min方法优于63℃20min方法.见表3

3 讨论

从实验结果得出三种方法通过处理稀释血清可以做到使盐水凝集程度下降而最后抗体滴度没有下降，可以知道此凝集是由于IgG型抗体而非IgM型抗体破坏不完全引起，保障了检测IgG型抗体结果准确。

本实验利用IgG具有耐热的物理特性，通过加热加速分子间的化学反应，快速破坏不耐热的IgM抗体[6]，致敏红细胞，缩短温育时间，可使产前免疫性抗体检测在10～20min内完成。试验结果表明，水浴法优于化学法，实验时间短，同时IgM抗体活性破坏完全。水浴法成功破坏了血清中的IgM抗体，保证了IgG抗体性质不变，使IgG抗体測定准确无误。通过本实验显示，运用63℃10min与DTT30min处理血清后，测定IgG抗A（B）效价，结果无统计学差异（P>0.05）。

通过实验显示两种水浴法与DTT法有高度正相关性，63℃10min方法优于63℃20min（R2=0.9177）。DTT还有化学致癌性[7]，实验操作时间长， DTT对IgM抗体中和能力较差[7]。63℃加热10分钟操作简单，易控制，影响因素少，没有致癌性，对身体影响小，试验时间也较DTT短，是值得运用的技术。

参考文献

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