腐植酸对镉胁迫下油菜生长及抗氧化系统的影响

肖丹丹 苏秀荣 吴钦泉 宋以玲 路艳艳 陈士更 丁方军 ，4

1 农业农村部腐植酸类肥料重点实验室 泰安 271600

2 山东农大肥业科技有限公司 泰安 271600

3 山东农业大学化学学院 泰安 271600

4 土肥资源高效利用国家工程实验室，山东农业大学资源与环境学院 泰安 271600

近年来，随着工农业生产的发展，工业“三废”排放量增加，固体废弃物处理不善，农业自身污染加剧，这些有毒重金属会通过植物吸收重金属经食物链进入人体，严重威胁人类健康。因重金属具有毒性强、长期性和非生物降解性，以致土壤重金属污染成为当今严重的环境问题，镉（Cd）已被公认为是毒性最强的元素之一[1]。目前我国部分区域土壤Cd污染问题非常严峻，例如：上海蚂蚁浜地区污染土壤Cd的质量分数达21.48 mg/kg，广州郊区老污灌区土壤Cd的质量分数高达228.00 mg/kg，沈阳张士灌区一闸土壤Cd的质量分数达5.00～76.68 mg/kg[2]。因此，研究重金属Cd对植物生理作用的影响具有重要意义[3～6]。

研究发现，向Cd污染土壤中施入腐植酸（HA），可增强土壤对重金属Cd的固定，提高土壤对重金属Cd的钝化作用，减少植物的吸收，阻碍Cd进入食物链[7]。一方面可能是腐植酸含有大量的羟基、羧基、羰基、甲氧基等官能团，能与Cd结合，形成螯合物和络合物等形态，促使土壤中交换态Cd向铁锰氧化物态、残渣态转换，从而降低其生物活性；另一方面，可能是腐植酸影响土壤的其他基本性状，间接影响土壤Cd有效性；而且腐植酸在农业生产中具有“改良土壤、增效化肥、刺激生长、增强抗逆、改善品质”五大作用。因此，本研究以油菜为材料，研究了腐植酸对Cd（60 mg/kg）胁迫下油菜体内Cd、硝态氮含量，过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）活性，以及丙二醛（MDA）含量和超氧阴离子自由基（O2·-）产生速率等生理特性的影响，探讨腐植酸缓解重度Cd胁迫的生理机理，为探明腐植酸缓解植物Cd毒害机理提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

试验在山东省泰安市肥城市山东农大肥业科技有限公司试验基地进行。供试肥料为普通白粒复合肥N-P2O5-K2O（24-12-12），由该公司提供。供试土壤为棕壤，取自本公司试验田，其基本理化性质：pH 6.34，碱解氮66.37 mg/kg，全氮0.56 g/kg，有效磷21.45 mg/kg，速效钾33.18 mg/kg，有机质10.81 g/kg，土壤Cd 0.01 mg/kg。供试油菜品种为“华绿一号”。供试腐植酸由山东创新腐植酸科技股份有限公司提供，其基本理化性质：pH 6.7，总腐植酸含量37.1%（湿基），游离腐植酸含量16.9%（湿基），E4/E6=4.7，含水量28%。

1.2 试验方法

本试验为盆栽试验。在试验田取5～20 cm表层土，晾晒风干后过2 mm筛备用。以溶液形式加入CdSO4·10H2O，Cd浓度为60 mg/kg（参照我国部分镉污染区域土壤镉质量分数设计），处理浓度分别以纯Cd计。以不加Cd处理作对照。土壤加入Cd溶液后，充分混匀，保持土壤持水量70%，平衡10天，然后风干，分别与不同量的腐植酸混匀后装盆，每盆盛土3.0 kg。每盆施复合肥1 g，每个处理重复3次，随机区组排列。各处理详见表1。

表1 试验处理Tab.1 The experimental treatment

1.3 测量指标及方法

油菜体内Cd含量测定采用GB 5009.15-2014，硝态氮含量测定采用紫外吸收法[8]。POD活性的测定采用愈创木酚法，以每分钟A470上升0.01为1个酶活性单位（U），以U/（min·g FW）表示。SOD活性测定采用氮蓝四唑法（NBT），以NBT光化还原被抑制50%的酶液量为1个酶活性单位，以U/（g FW）表示。CAT活性的测定采用紫外吸收法，以每分钟A240减少0.1的酶量为1个酶活性单位，以U/（min·g FW）表示。MDA含量的测定采用硫代巴比妥酸法。O2·-产生速率的测定采用羟胺氧化法[9]。

酶液制备：取0.5 g油菜叶片，加入5 mL浓度为0.05 mol/L，pH为7.8的磷酸缓冲液在冰浴下研磨至匀浆，匀浆倒入离心管中，低温（0～4 ℃）离心20 min，转速为10000转/分钟。上清液倒入离心管中，至0～4 ℃保存备用。

1.4 数据统计分析

数据采用Microsoft Excel 2007 软件进行绘图，用DPS 9.50软件进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 不同处理对Cd胁迫下油菜Cd含量的影响

图1为不同处理对Cd胁迫下油菜Cd含量的影响。由图可见，与对照相比，单独Cd胁迫条件下，显著提高了油菜叶片和根系内Cd含量，添加不同用量的HA处理均显著降低了油菜叶片和根系内Cd含量，且随着HA添加量的增加，油菜叶片和根系内Cd含量呈现先显著降低，后趋于平稳的趋势。当HA添加量为2 g/kg时，与单独Cd胁迫处理相比，油菜叶片和根系内Cd含量分别显著降低了59.2%和30.9%，且当HA添加量高于2 g/kg后，与2 g/kg处理对比，对油菜叶片和根系内Cd含量无显著影响。因此，HA添加量达2 g/kg时，抑制油菜对土壤内Cd的吸收效果最佳。

2.2 不同处理对Cd胁迫下油菜体内酶活性的影响

植物在生长过程中难免会遭受生物和非生物逆境胁迫，其代谢过程就会产生自由基破坏细胞膜；POD、SOD、CAT作为植物自身的酶保护系统，可通过各种代谢过程来清除自由基，降低氧化损伤[10]。在一定程度上清除各种逆境因子胁迫下所产生的活性氧，使体内活性氧维持在一个相对稳定的水平，从而有效地阻止过氧化物质在植物体内积累[11]。表2为不同处理对Cd胁迫下油菜体内酶活性的影响。由表可知，与CK相比，单独Cd胁迫条件下，显著降低了油菜体内POD、SOD和CAT活性，表明Cd胁迫下，致使油菜体内部分酶失活，从而导致油菜体内抗氧化系统失衡。油菜叶片出现失绿、变黄、叶尖卷曲变干等症状时，表明油菜已经出现中毒现象。在Cd胁迫下，施用HA后，油菜体内POD、SOD、CAT活性升高，且SOD和POD活性均随HA添加量的增多而逐渐升高。当HA添加量达到1 g/kg时，SOD和CAT活性与正常处理相比，无显著差异，说明添加HA明显缓解了Cd胁迫对油菜体内POD、SOD和CAT活性的抑制作用，提高了油菜的抗氧化能力，缓解了Cd胁迫造成的氧化损伤，增强了油菜抵抗Cd胁迫的能力。

图1 不同处理对Cd胁迫下油菜Cd含量的影响Fig.1 Effects of different treatments on Cd content in rape under Cd stress

表2 不同处理对Cd胁迫下油菜体内酶活性的影响Tab.2 Effects of different treatments on activities of enzymes in rape under Cd stress

2.3 不同处理对Cd胁迫下油菜体内MDA含量和O2·-产生速率的影响

MDA是在植物器官衰老或逆境条件下，发生膜脂过氧化作用而产生的最终分解产物，其含量可以反映植物遭受逆境伤害的程度。图2为不同处理对Cd胁迫下油菜体内MDA含量和O2·-产生速率的影响。由图可见，Cd胁迫条件下，显著提高了油菜体内MDA含量，添加HA后其含量不断降低，均与单独Cd胁迫处理间存在显著性差异，且随HA添加量的增加而逐渐降低。O2·-是植物体内的第一个氧自由基，在细胞信号转导和氧感应方面具有重要的作用，浓度适宜时可作为胞内信号分子，但含量过高时又会引起自由基链锁反应，最终转化成H2O2、羟基自由基（·OH）和单线态氧（1O2）等自由基，而导致氧化损伤[12]。由图2可见，Cd胁迫条件下，油菜叶片内O2·-产生速率显著高于CK，添加HA后，O2·-产生速率的变化趋势与MDA相似，均随HA添加量的增多而降低。以上结果表明，HA可通过提高Cd胁迫下油菜体内抗氧化物酶的活性来降低MDA含量和O2·-产生速率，减轻油菜体内膜脂过氧化损伤，从而提高油菜的抗逆性。

图2 不同处理对Cd胁迫下油菜体内MDA含量和O2·-产生速率的影响Fig.2 Effects of different treatments on MDA content and the generation of O2·- in rape under Cd stress

2.4 不同处理对Cd胁迫下油菜体内硝态氮含量的影响

硝态氮是植物的重要氮源，植物体内硝态氮含量可以反映土壤氮素供应情况。特别是叶菜类和根菜类蔬菜中常含有大量硝酸盐，在烹饪和腌制过程中可转化为亚硝酸盐而危害健康。因此，硝酸盐含量高低是衡量蔬菜品质、安全性的一个重要指标，同时能够反映作物的氮素营养状况[13]。图3为不同处理对Cd胁迫下油菜体内硝态氮含量的影响。由图可见，单独Cd胁迫条件下，油菜体内硝态氮含量明显升高，但差异不显著，而随着HA添加量的增加，油菜叶片内硝态氮含量显著降低，且低于对照处理，差异达显著水平。说明HA对降低Cd胁迫下油菜体内硝态氮的形成和累积有很好的效果，且低于非Cd胁迫下油菜体内硝态氮的含量。

图3 不同处理对Cd胁迫下油菜体内硝态氮含量的影响Fig.3 Effects of different treatments on nitrate nitrogen content in rape under Cd stress

3 讨论与结论

张树杰等[14]认为Cd胁迫显著抑制了油菜幼苗的生长，植株根系和地上部干重随着Cd浓度的升高而显著降低；同时，油菜幼苗体内抗氧化酶（POD、SOD和CAT）活性在高浓度Cd胁迫时显著降低。刘丽莉等[15]研究表明，Cd胁迫浓度达到600 μmol/L时，显著提高了油菜体内MDA含量，降低了SOD和CAT活性，从而降低了油菜抗氧化酶保护系统的功能，加剧了膜系统的氧化损伤。

任学军等[16，17]研究表明，HA能明显降低小麦幼苗体内Cd含量；能显著降低Cd污染土壤种植小白菜体内重金属Cd的积累量，且对重金属Cd积累的抑制效应随HA添加量的增多而逐渐增强，并获得了最佳的添加范围，即1.0～2.0 g/kg。彭正萍等[18]研究认为，HA能显著降低油菜体内硝酸盐含量，提高Vc、可溶性糖含量以及POD和SOD活性。本研究与以上研究结论基本一致，具体为：在Cd胁迫下，添加不同用量HA，油菜体内Cd含量随HA添加量的增加而降低，HA最佳添加量为2 g/kg；土壤中添加HA后降低了油菜体内硝态氮含量，提高了POD、SOD和CAT活性，降低了MDA含量和O2·-产生速率，促使油菜抗氧化酶系统恢复平衡、膜脂过氧化得到缓解。因此，在Cd含量较低，污染程度轻的土壤上有望通过添加一定用量的HA来降低Cd在作物体内的累积，以达到食物所要求的最低检出限，提高产品安全性。但仍需针对不同程度Cd污染土壤、不同作物以及腐植酸产品种类和用量等做相关研究。