可逆的细胞死亡进程

2019-04-29编译传植

世界科学 2019年4期

编译传植

分子编程或能逆转细胞凋亡及其他形式的细胞程序性死亡。

2007年，邓浩雯停下她在爱荷华州立大学的本科学习，参加到在香港中文大学攻读博士的哥哥邓浩林的工作中。那时，邓浩林在冯明钊的免疫学实验室研究细胞骨架破坏对细胞凋亡（apoptosis）中线粒体破碎的作用。细胞凋亡是研究最多的细胞自杀形式，但兄妹二人认为一个更基本的问题还悬而未决：一旦细胞凋亡启动，细胞还能从一地鸡毛中重生吗？

细胞凋亡的启动因素众多，但任何途径最终的刽子手都将是胱冬肽酶（caspase）。胱冬肽酶肆意破坏细胞中数以百计的各类蛋白质，损伤染色体，攻击组成细胞器的结构蛋白，并拆解细胞骨架，于是细胞皱缩、出泡、破碎，看似已无回天之力。“在那时，其实一直到现在，大家的看法都是细胞凋亡不可逆，”邓浩林回忆道，“我和浩雯很好奇，事实果真如此吗?”

兄妹二人试着用乙醇之类的有毒物质处理人类癌细胞，观察到特征性的细胞凋亡征兆，如胱冬肽酶的激活和细胞皱缩。接着，他们并没有就这样在实验结束后扔掉那些“死”细胞。“我们洗去毒素，加入新鲜的培养基，然后培养过夜。”邓浩林说。

“第二天早上观察的时候，我们都很惊讶，有些细胞又恢复了正常的形态。”他们给这个现象命名为“复活（anastasis）”。apoptosis一词在希腊语中有“坠落、降落”之意，这一现象保证了细胞群的正常周转，像是花谢时落下的花瓣，或是满地的秋叶。而anastasis则是其反面，意味着“升起”，同时在基督教中也指耶稣复活。

学术圈最初对细胞复活持怀疑态度。“我们的发现相当有争议，最开始的几篇文章在3年内被拒稿11次以上。”邓浩林说。他现在是约翰霍普金斯大学的分子和遗传生物学家。

在邓浩林加入约翰霍普金斯大学细胞和发育生物学家丹妮斯·蒙特尔（Denise Montell）的实验室后，得到了更多有关细胞复活的实验证据。同他的新实验团队、他之前在中国的同事以及他的妹妹——她读完硕士学位后从爱荷华州跟着哥哥来到了巴尔的摩——一起，邓浩林的实验对象不再局限于海拉（Hela）细胞这种人类癌细胞系，也拓展到培养的小鼠肝细胞、大鼠心脏细胞、白鼬脑细胞以及包括成纤维细胞的多种人类细胞。实验中，细胞似乎也能从凋亡晚期恢复，甚至DNA被破坏和细胞破碎后也是如此。“我们录下了一段人类肺癌细胞皱缩、出泡，最后恢复过来的影像，那时我就认定这一现象意义重大，”现就职于加州大学圣芭芭拉分校的蒙特尔表示，“这很惊人。”

2012年，这一现象正式被命名为“细胞复活”，之后，研究者钻研于细胞在凋亡时被严重破坏后复原的具体机制。科学家见证了培养的人类细胞中破碎的线粒体又恢复原样，以及细胞凋亡过程中mRNA的产生与储存，犹如是计算机的高速缓冲储存器，启动并推进了细胞的复活。同时也发现了果蝇体内存在细胞复活的证据。

“我们一致认为细胞凋亡现象是要么有要么无的，所以这一发现相当有趣，我们一举推翻了一直以来的看法，”英国格拉斯哥大学细胞生物学家史蒂芬·泰特（Stephen Tait）说，“胱冬肽酶破坏了细胞中那么多蛋白质，细胞不像能活下来的样子，而事实恰恰相反。”

“这将改变科学家们在细胞层面对生存和死亡的定义，”匹兹堡大学医学中心免疫学家和细胞生物学家巩乙南（Yinan Gong）补充道，“对细胞而言，死亡是什么呢？”

细胞如何幸存

细胞可以活很久，甚至可以长达几年，然而一旦细胞凋亡开始，死亡会立刻降临。胱冬肽酶被激活后的10分钟内，细胞将出现可见的变化：细胞皱缩，细胞膜扭曲，DNA固缩成束而后裂解开来。胱冬肽酶同时也使磷脂酰丝氨酸分子从细胞膜内外翻，成为吞噬细胞的吞噬标记。法国里昂大学的细胞生物学家加布里埃尔·伊希姆（Gabriel Ichim）说：“激活胱冬肽酶就像雇了一个杀手，它在5到10分钟内分解几百个细胞内容物并杀死细胞。”

细胞凋亡的因素可能多种多样，但是最终都会启动胱冬肽酶，它破坏细胞的DNA、细胞器和细胞骨架。它也募集其他细胞吞噬将死细胞的残骸。即使这一细胞自杀途径已经启动，细胞仍然能通过细胞复活这一新发现的过程来进行恢复。但如果细胞复活发生于细胞凋亡晚期，那么幸存的细胞会有很多染色体瘢痕，以及一些其他的基因缺陷，可能造成恶性肿瘤的发生。

2015年，伊希姆、泰特和一些同事在培养的人类细胞中发现了与细胞复活相似的另一种现象，称为“失败的凋亡”：细胞在部分经历凋亡的特征性变化后又恢复了。过去认为当细胞线粒体开始漏出细胞色素c这一强效胱冬肽酶激活剂后，细胞中所有细胞器将同步地发生这种变化。然而研究者仔细研究后发现，有时只有一部分细胞线粒体发生漏出，意味着只有一小部分胱冬肽酶被激活，于是细胞得以幸存。

“正如细胞复活，失败的凋亡同样说明凋亡的启动并不像人们常常认为的，是对细胞宣判死刑。”泰特说。但失败的凋亡发生于经历部分凋亡进程的细胞——细胞中被激活的胱冬肽酶水平远低于凋亡成功发生的情况，也只有一定数量的酶解目标被破坏。而邓氏兄妹的发现完全不同：细胞即使完全经历了凋亡进程，也能够恢复。

2019年早些时候，研究者发表的研究显示：延时活细胞显微镜下海拉细胞的碎片重新组装成一个形态上明显正常的细胞。似乎细胞凋亡的启动因素无关紧要，如果条件合适，那么细胞复活进程将拯救经历了各种打击的细胞，包括冷性休克、蛋白质缺乏以及接触毒性化学物质。邓氏兄妹和同事们发现，如果细胞已经到了凋亡进程的晚期，线粒体碎片甚至能融合并重新恢复正常结构。恢复中的细胞也在几小时内摆脱了细胞膜表面的吞噬标记，因而逃过了吞噬细胞。

2017年，蒙特尔和邓氏兄妹分别独立发表了细胞复活分子信号的深入研究。蒙特尔团队发现凋亡进程中的海拉细胞在获得新鲜培养基后，会有超过1 000个基因被上调，而在一定程度上，这一分子效应类似于细胞通过自噬恢复时发生的，细胞通过自噬这一进程保证了蛋白和细胞器的回收利用。同时，与细胞恢复相关的mRNA在细胞凋亡进程中断前就显著积累，意味着细胞在凋亡进程早期就开始为可能的细胞复活做好了准备。在小鼠原代肝细胞的实验中，邓氏兄妹和同事们注意到涉及受损线粒体、有害自由基和一些其他细胞组分清除的基因发生了显著变化，同时发生细胞周期的阻滞，或许是为细胞修复创造条件。

细胞的第二次生命。活细胞共聚焦显微镜下的海拉细胞：上图为诱导产生细胞凋亡前；中图为用乙醇诱导细胞死亡后；下图为清洗后用新鲜培养基培养30小时后

泰特说：“关键信息很明确，细胞死亡没有被正确定义，我们曾经认为细胞非死即活，但我现在认为生死间存在着大量的灰色地带。”

证实细胞复活

尽管科学家开始认为细胞凋亡并非最终结局，但仍然有人对这些结论持怀疑态度。其中一种怀疑观点是这些暴露于凋亡诱导因素的细胞是否真正激活了胱冬肽酶，或者是这些细胞实际上从中逃逸出来，而并没有激活最终的刽子手。这些经历了细胞复活的细胞与周围的健康细胞难以区分。“我们很难长期追踪这些幸存下来的细胞，尤其是在体内。”伊希姆说。

为了追踪体内凋亡后幸存下来的细胞，邓氏兄妹和蒙特尔分别在2015和2016年开发了基因结构CaspaseTracker7和CasExpress8，它们在胱冬肽酶激活时产生荧光蛋白，并能够保持发出荧光的状态。单细胞和延时活细胞显微镜就能以此掌握细胞的命运。

这种手段让试验组首次观察到体内的细胞复活。邓氏兄妹和蒙特尔利用这些基因结构，观察到果蝇胚胎中多种组织在表现出如细胞皱缩和膜出泡这类细胞凋亡特征后，完全恢复的过程中，胱冬肽酶确实被激活。研究者如今在探究啮齿类动物是否也是如此。

但这一结果还不能说明问题，其中一种质疑的声音是胱冬肽酶并非仅仅在细胞死亡中有它的作用。譬如，“在神经系统中，与学习和记忆相关的神经元修剪过程也激活了胱冬肽酶，”斯坦福大学化学生物学家斯考特·迪克逊（Scott Dixon）提到，“因此，胱冬肽酶并非就是细胞凋亡的特征性标志。”

蒙特尔和她的同事们注意到细胞复活与其他涉及胱冬肽酶过程的不同之处：非凋亡胱冬肽酶的激活仅仅发生于过程中的特定阶段，并出现在组织的所有同类细胞中；在细胞复活过程中，则在时间上分散地出现于任意细胞中。但蒙特尔也同样认为，在明白究竟发生了什么之前，还有许多工作要做。假设细胞确实可以在某些情况下从细胞凋亡或其他一些看似致命的过程中恢复，那么这种现象有多广泛，而又有多重要呢？“这是全新的领域，”不列颠哥伦比亚大学细胞和分子生物学家舒卡特·德哈尔（Shoukat Dedhar）说，“除了要证实邓氏兄妹、蒙特尔和其他人的早期发现外，研究者还要探讨这一现象的存在意义。”

细胞凋亡恢复的效果

“细胞复活的功能可能是一种细胞存活机制，”邓浩林指出，“由此细胞可以在面对暂时的困境时，限制永久性的损伤。”比如说，发育中器官内的组织有可能会短暂地缺乏生长因子，这可能导致细胞在快速增殖的同时发生细胞凋亡。蒙特尔和她的同事们发现果蝇发育时体内可能存在细胞复活现象，幼虫脑和成虫盘中的细胞可能从胱冬肽酶手中存活下来，并随着变态过程，成长为成虫肢体和器官。

细胞复活同时可能有利于进化，邓浩林说：“我们的研究显示果蝇生殖细胞在短暂暴露于像饥饿和冷性休克等生理和环境应激后，会出现细胞复活的现象。而这提高了细胞获得新变异的概率，这种变异来自细胞凋亡，并能传给后代。”

细胞复活的作用可能不只是单纯的自我保护。2012年，邓氏兄妹和蒙特尔发现在细胞从凋亡恢复的过程中，可以修复损伤的基因，但修复过程中可能出错。因此，存活下来的细胞会有染色体异常和其他的基因缺陷，并可能发展为恶性肿瘤。这意味着如果细胞反复多次经历命悬一线的困境，如组织反复受到损伤，会产生更高癌变的概率，例如酗酒导致肝癌，经常饮用热饮导致口腔、食管或胃癌。据泰特、伊希姆和他们同事的研究结果，即使细胞凋亡没有进行到底，损伤并不那么严重，但细胞染色体可能会因此变得不稳定，有些细胞甚至可能发展为恶性肿瘤。“我们长时间追踪细胞来研究它是否会癌变，结果发现它们的染色体变得不稳定了，”伊希姆说，“变得咄咄逼人，小鼠会在体内形成较大的肿瘤。”

细胞逃脱程序性死亡的能力也许还能够解释一些治疗方法对癌细胞效果不佳。放疗和一些常用的化疗药正是通过诱导细胞凋亡进行治疗，这对大部分肿瘤细胞是有效的，然而一旦有幸存的癌细胞，那么就有复发和转移的可能性。“这些癌细胞可能会进一步通过变异获得耐药性。”德哈尔说，他现在正在寻找那些“从鬼门关回来的”癌细胞被激活的分子途径。

邓浩林和同事们发现果蝇体内细胞复活的过程中，与血管生成和细胞迁徙相关的基因会被激活，这一过程增强细胞吸收营养、清除废物的能力，有利于细胞从凋亡中的恢复。而这些变化也能加强癌细胞的传播能力。

如果癌症和细胞复活间存在这种联系，那么靶向这一过程的干预治疗将预防癌症发展，或将其扼杀于摇篮之中。邓浩林说：“在治疗癌症过程中和之后抑制垂死癌细胞的复活将是一种全新的治疗策略，它能够阻止癌症复发，治愈癌症。”

他同时提到，与之相反的情况是，对于那些不可再生细胞受损造成的疾病，譬如心肌细胞和神经元疾病，细胞复活或许也能成为一种治疗手段。“现在我们实验室的一个主要研究方向是找出细胞复活的调控手段，以及促进或抑制细胞复活的小分子，”邓浩林说，“这些研究成果将给我们提供控制细胞复活的必要工具，以此为基础，会打开探索细胞复活潜在功能和疾病治疗价值的新天地。”

最根本的是，更好理解细胞复活除了能够救治受伤患疾的细胞，还将让科学家更好地理解细胞死亡。“我们怎样才能在单细胞层面上预测细胞的命运，这个问题是我们的圣杯，”巩乙南说，“比如说，如果我们对肿瘤进行放射治疗，我们也许知道肿瘤会缩小90%，但我们不知道是哪90%。预测哪些细胞会死亡，又会怎么死亡，这些有利于我们将副作用最小化，而疗效最大化。这才是细胞死亡的2.0版本。”

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细胞复活：细胞如何骗过死神

启动细胞凋亡的因素可能多种多样，但是最终都会启动胱冬肽酶，它破坏细胞的DNA、细胞器和细胞骨架。它也募集其他细胞吞噬将死细胞的残骸。即使这一细胞自杀途径已经启动，细胞仍然能通过细胞复活这一新发现的过程来进行恢复。但如果细胞复活发生于细胞凋亡晚期，那么幸存的细胞会有很多染色体瘢痕以及一些其他的基因缺陷，可能造成恶性肿瘤的发生。

细胞凋亡

细胞复活

1.细胞凋亡的启动因素有很多。一旦细胞凋亡启动，会出现线粒体外膜通透化（MOMP），是线粒体破裂过程的关键

2.MOMP促使细胞色素c和一些其他因子释放，启动凋亡小体的形成，它具有激活胱冬肽酶的作用

3.胱冬肽酶破坏DNA修复相关蛋白，并激活破坏DNA的酶

4.胱冬肽酶同时攻击细胞骨架细胞，导致细胞皱缩变形

5.细胞膜分子磷脂酰丝氨酸从膜内外翻，成为吞噬细胞的标记，促进吞噬细胞的吞噬

1.一定数量的热休克蛋白将抑制MOMP和胱冬肽酶的激活

2.破碎的线粒体重新黏附在一起，同时一部分完好或有部分功能的线粒体为细胞恢复提供能量

3.细胞在因凋亡而死亡前，内部会累积mRNA，这有利于细胞的快速恢复

4.受损的蛋白、线粒体和其他细胞组分通过自噬或其他途径被清除

5.细胞表面磷脂酰丝氨酸的吞噬标记被去除

6.细胞复活能诱导血管生成和细胞迁徙，有利于细胞吸收营养，并清除凋亡产生的废物。同时它阻滞细胞周期给细胞修复的时间

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死亡的多面性

细胞复活并非是给细胞缓刑的唯一形式。2018年，匹兹堡大学医学中心的免疫学家和细胞生物学家巩乙南和同事们出乎意料地在有关哺乳动物细胞基因沉默的实验中，发现了细胞程序性死亡的另一种形式——坏死性凋亡（necroptosis）同样能够被逆转。

细胞坏死是细胞在遭受伤害或应激后产生的失控反应，而坏死性凋亡则是程序性的坏死过程，其中一种具有混合系列蛋白激酶样（mixed lineage kinase-like，MLKL）结构域的蛋白质在细胞膜上开孔，破坏细胞。巩乙南和同事们发现坏死性凋亡并非一定致命。ESCRT-III蛋白复合物能够将这些孔道分离开来，形成新的膜泡。而将这些膜泡分离出去就能够修复细胞，这一过程被称为“复苏”。实验组猜测坏死性凋亡将在MLKL彻底淹没ESCRT-III后发生。

另一些细胞死亡形式也能逆转。2012年，斯坦福大学的化学生物学家斯考特·迪克逊发现细胞铁死亡（ferroptosis）这种依赖铁元素的细胞死亡形式，能够以脂溶性抗氧化剂和铁螯合剂进行治疗并逆转。“一些人认为一旦细胞暴露于致命的刺激后，就没有生还的机会了，”迪克逊说，“但研究告诉我们即使细胞受到了致死的刺激，在一定时间内还是有机会进行干预并救回细胞的。”

即使细胞侵入性死亡（entosis）这种可怕的细胞死亡形式——细胞活吞另一个细胞——也是可逆的，被吞入的细胞会脱离出来，并继续活下去。“细胞被吞了之后，它的细胞核看起来还是正常的，细胞膜也是正常的，通过延时摄影，我们发现它能够逃出来并继续分裂，功能相当正常，”纽约纪念斯隆-凯特琳癌症中心细胞生物学家迈克·奥尔霍尔兹（Mike Overholtzer）说，“细胞甚至被吞噬了也能进行分裂，然后逃脱，活性很好。”他和同事们发现侵入性死亡在人类癌症中很普遍，但决定被吞噬细胞命运的是什么仍不明晰。

总而言之，这说明这些途径并不一定意味着死亡。“当医生宣判一个人的死亡时，现在其明确的定义是脑死亡。我们明白当病情发展到一定程度，医生就无能为力了，”巩乙南说，“但细胞究竟是到了哪才能说它无力回天呢？”