乳腺癌的多层螺旋CT征象与VEGF和CD34表达水平相关性研究

孔丹青 司 文 王 坤

乳腺癌是发生在乳腺腺上皮组织的恶性肿瘤，但由于乳腺并不承担维持机体正常运转的生理功能，原位乳腺癌不会构成生命威胁，但若原位癌细胞脱落成为游离癌细胞，则可随距离乳腺最近的淋巴循环传播，感染机体其他健康器官组织，对患者构成生命威胁[1]。

近年来，由于生活压力和环境污染，越来越多的女性罹患乳腺癌，且患者的首次发病年龄有年轻化的趋势[2]。目前，对于乳腺癌的根治性治疗方法迄今仍首推外科治疗。为了提高患者的预后，早发现早诊断早治疗十分重要。

目前，多层螺旋CT成像已被广泛运用到对肿瘤良恶性判断、肺癌分期、肿瘤诊断等多个领域中。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)水平作为机体内重要的血管生长调节因子，参与到癌细胞的生长、分化和增殖中[3]。VEGF对于促进新血管的生成有着重要作用。跨膜糖蛋白CD34特异性地表达于血管内皮细胞，也参与到肿瘤新血管的生成过程当中。VEGF和CD34均与肿瘤细胞的增殖生长有关，同时对两者在乳腺癌组织中的表达进行研究，将有助于了解两者之间的关系[4-5]。本研究旨在探讨VEGF和CD34的表达与乳腺癌CT征象的相关性，从而揭示乳腺癌发生发展的生物学机制。

1 资料和方法

1.1 一般资料

采用前瞻性研究模式，选取2013年2月至2016年2月解放军第307医院进行手术治疗的120例乳腺癌患者，将其纳入观察组，其年龄25～54岁，平均年龄(39.8±3.6)岁；84例为浸润性导管癌，27例为浸润性小叶癌，13例为勃液腺癌；已婚93例，未婚27例；根据乳腺癌(tumor node metastasis，TNM)分期，120例患者中Ⅰ期34例、Ⅱ期54例、Ⅲ期32例；120例患者由个人意愿和临床治疗最优方案选择，均自愿接受乳腺癌根治术。另选64例经病理检查确定为非乳腺癌患者，并将其纳入对照组，其年龄24～57岁，平均年龄(38.4±3.9)岁；已婚89例，未婚31例。两组患者基本情况无显著差异，具有可比性。本研究获得医院医学伦理委员会的批准，所有患者均对研究内容知情并签署同意书。

1.2 纳入与排除标准

(1)纳入标准：①所有入院患者均因乳腺增生、肿块等经穿刺活检确诊为乳腺癌或非乳腺癌；②神智清晰，能做出自主判断；③治疗依从性好，可以配合完成各项检查；④年满24周岁。

(2)排除标准：①存在心肝脑肾等其他主要脏器耗损性疾病患者；②精神疾病患者；③其他部位恶性肿瘤患者；④病历资料不全者；⑤个人意愿不希望接受手术治疗者。

1.3 仪器设备

CT检查采用SOMATOM Spirit多层螺旋CT机(德国西门子医疗有限公司)；本研究所用酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)试剂盒均购自优尔武汉生物科技公司，严格按照试剂盒说明书所述步骤操作。

1.4 检测方法

(1)CT灌注成像。观察组患者接受CT检查，取俯卧位，使其双乳呈自然下垂状态，嘱其平静呼吸，在听到相应指令后屏气进行扫描。首先进行CT平扫找到所见肿瘤的最大层面，以此为中心采用多次且连续的同层扫描进行动态扫描，参数设置如下：管电压120 kV、管电流50 mA，重层厚5 mm，探测器宽度24 mm×1.2 mm，扫描间隔1.0 s，Z轴覆盖4 cm，延迟5 s起扫。对照组患者采用与观察组一致的检查方法和参数设置。

(2)血液样本采集和检测。所有患者均禁食12 h后取静脉血，离心，收集血清用于血浆VEGF蛋白表达水平测定。采用ELISA测定患者血浆中VEGF蛋白表达水平。

(3)组织样本采集和检测。所有患者的活体组织一经采集，均放入10%的中性甲醛溶液中进行固定，并进行石蜡包埋，而后将其制成4 μm的组织切片，用于CD34蛋白表达的检测。CD34抗体购自Santa Cruz公司。检测方法为免疫组化法，以磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution，PBS)为阴性对照，采用缓冲液对组织切片进行20 min抗原高温修复，而后用PBS进行冲洗15 min。而后加入相应抗体，在4 ℃环境下放置超过8 h。再用PBS进行冲洗6 min。顺序加入聚合物辅助剂pv-9000试剂一和试剂二，分别放置20 min后用PBS进行冲洗6 min。观察免疫组化检测结果，并采用CMIAS真彩色医学图像分析系统对切片进行分析，随机选择每张切片的5个视野(×200)，分别检测积分光密度(integral optical density，IOD)，取平均值作为该染色切片中相应蛋白的表达情况。

1.5 观察与评价指标

观察统计两组患者术前血浆VEGF蛋白表达水平和组织切片中CD34蛋白表达情况，由同一组医师对观察组患者的CT图像进行检查，并统计患者CT征象中显示出的肿块大小、形态、边缘情况、微小钙化点、血流显像分级和是否存在淋巴结转移等情况，并根据患者不同的CT征象将其分为不同的组别，统计不同CT征象患者血浆VEGF蛋白表达水平和组织CD34蛋白表达差异，并分析血浆VEGF蛋白表达和组织CD34蛋白表达之间的相关性。

表2 CT征象与血浆VEGF蛋白和组织CD34蛋白表达水平相关性分析

表2 CT征象与血浆VEGF蛋白和组织CD34蛋白表达水平相关性分析

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1.6 统计学方法

采用SPSS 17.0统计分析软件对各项指标之间的差异进行评价。计量资料用(x-±s)表示，使用t检验，血浆VEGF蛋白表达和组织CD34蛋白表达之间的相关性分析采用Spearman相关系数分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者血浆VEGF蛋白和组织CD34蛋白水平比较

两组患者的血浆VEGF蛋白和组织CD34蛋白水平表达所示，观察组患者组织CD34蛋白表达水平显著高于对照组患者，差异有统计学意义(t=21.954，P＜0.05)，而血浆VEGF蛋白表达水平也显著高于对照组患者，差异有统计学意义(t=18.415，P＜0.05)，见表1。

表1 血浆VEGF蛋白和组织CD34蛋白水平比较

表1 血浆VEGF蛋白和组织CD34蛋白水平比较

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2.2 CT征象与血浆VEGF蛋白和组织CD34蛋白表达的相关性分析

在观察组患者CT征象与血浆VEGF蛋白和组织CD34蛋白表达水平的相关性分析中，血浆VEGF蛋白和组织CD34蛋白表达水平，在不同肿块大小、边缘形态以及微小钙化点的患者体内表达差异无统计学意义[VEGF蛋白(t=0.17，t=1.28，t=2.97；P＞0.05)CD34蛋白(t=0.42，t=1.17，t=0.43；P＞0.05)]；但是肿块形态规则的患者体内血浆VEGF蛋白表达和组织CD34蛋白表达水平显著高于不规则患者，差异有统计学意义(t=17.46，t=7.98；P＜0.05)；血流显像分级在2～3级的患者体内血浆VEGF蛋白表达和组织CD34蛋白表达水平显著高于0～1级患者，差异有统计学意义(t=19.68，t=16.86；P＜0.05)；而淋巴结转移的患者体内血浆VEGF蛋白表达和组织CD34蛋白表达水平显著高于不存在淋巴结转移的患者，差异有统计学意义(t=17.98，t=18.58；P＜0.05)，见表2。

2.3 血浆VEGF蛋白和组织CD34蛋白表达之间的相关性

根据文献查阅，将患者血浆VEGF蛋白表达高于105.00 μg/ml的称为阳性表达，组织CD34蛋白表达的I0D值＞35.00的称为阳性表达。血浆VEGF蛋白表达与组织CD34蛋白表达之间的相关性结果显示，在120例乳腺癌患者中，血浆VEGF蛋白表达和组织CD34蛋白表达同时阳性表达的有82例，只有血浆VEGF蛋白表达阳性的有1例，只有组织CD34蛋白表达阳性的有26例，有11例两种蛋白均为阴性表达。经Spearman相关系数分析，血浆VEGF蛋白表达与组织CD34蛋白表达之间呈正相关(r=0.9842，P＜0.05)，见表3。

3 讨论

乳腺癌作为严重威胁女性健康的一类恶性肿瘤，近年来，其发病趋势呈逐年上升的态势，且患病人群中年轻人群占比逐年上升，严重威胁女性的生命安全和生活质量。在乳腺癌的发病过程中，多种细胞因子均参与其中，对癌细胞的生长、分化、浸润和转移都起到关键调节作用[6-7]。在本研究中，选择了两种与肿瘤新血管生成有密切联系的蛋白VEGF和CD34，研究其在乳腺癌发生过程中的病理变化和作用。对乳腺癌和非乳腺癌患者的血浆和乳腺组织的检测结果显示，乳腺癌患者组织CD34蛋白表达水平和血浆VEGF蛋白表达水平显著高于非乳腺癌患者。VEGF是机体内一种非常重要的血管生长调节因子，其具有促进新血管生成的生理作用，血浆VEGF蛋白的高表达提示肿瘤组织周围血管的生长旺盛，确保肿瘤组织的充足的血氧供应[8-10]；CD34是一种跨膜蛋白，属于钙黏蛋白家族，其特异性在血管内皮细胞的细胞膜表面表达，其表达水平可以反映局部组织的微血管密度，从而反映局部组织的血供情况。乳腺癌患者肿瘤组织中CD34蛋白表达水平高，提示其在肿瘤细胞表面过度表达，促进肿瘤组织周围新的微血管的形成，保证肿瘤细胞充足的血氧供应[11-12]。

表3 血浆VEGF蛋白和组织CD34蛋白表达之间的相关性

多层螺旋CT是乳腺癌诊断和分期判定的影像学证据，不同分期和病理情况的乳腺癌患者其CT图像所显示出来的征象存在着差异。影像学图像特征的改变是宏观变化，这种宏观变化其实与组织内调控肿瘤细胞生长分化的细胞因子密切相关。正是因为有这些细胞因子的微观变化，才能使得肿瘤组织在宏观上反应出各种差异。CT图像征象提示乳腺癌存在淋巴结转移或乳腺癌血流显像处于2～3级的患者，其CD34和VEGF的表达水平更高。这是因为，存在淋巴结转移或血流显像处于2～3级的肿块都表示该乳腺癌周围血流丰富，微血管网络发达，侵袭周围健康组织的可能性大，由此表明，淋巴结转移和血流显像分级的超声征象提示的乳腺癌恶变程度与CD34和VEGF不同表达水平提示的乳腺癌恶变程度相一致[13-14]。此外，组织CD34蛋白表达和血浆VEGF蛋白表达还在肿块形态规则的患者体内高表达，本研究观察到，规则的肿块形态主要为圆形或类圆形，这类组织与周围组织和相互之间的连粘性很少，其内部组织结构往往即为混乱，肿瘤细胞的分化程度也较低，极易随淋巴发生转移[15]。本研究进一步分析血浆VEGF蛋白表达和组织CD34蛋白表达的相关性显示，这两种蛋白表达存在正相关，表明两者在乳腺癌发病的病理过程中，可能存在协同作用。同时，在对疑似乳腺癌患者进行分子生物学物质检查时，将这两种蛋白联合检查可以对检查结果相互印证，并相互补充，有助于为乳腺癌诊断和恶变程度的判断提供更多的依据。

乳腺癌的发病机制多样，其分子生物学特征也复杂多变，仅仅依靠CT检测或是分子生物学检查无法得到完整的结果。在临床中对乳腺癌的检查还需要同时运用多种检查手段，以发挥其各自之间的优势。一方面CT图像可以很好的对病灶位置、癌症分期和分型进行判断，但是其无法获得肿瘤组织内部的生物信息；另一方面蛋白质大分子产生自肿瘤细胞内部，可以很好的反应肿瘤组织的增殖分化状况，但是却无法直观的对肿瘤的外在表现进行把握[16-17]。因此，将两者有机的结合起来有助于临床工作者对肿瘤组织进行全面了解。

乳腺癌CT图像征象与血浆VEGF蛋白表达和组织CD34蛋白表达之间存在相关性，可以作为无创性预测乳腺癌患者血浆VEGF蛋白表达和组织CD34蛋白表达的方式，为乳腺癌恶变程度和预后的判断提供更多的依据。