全波长扫描式多功能读数仪-分光光度法测定土壤中无机氮

2019-04-28宋书会王汝健张金尧

中国无机分析化学 2019年2期

宋书会王汝健辛宇张金尧汪洪

(中国农业科学院农业资源与农业区划研究所，国家化肥质量监督检验中心(北京)，农业农村部农产品质量安全肥料源性因子风险评估实验室(北京)，北京 100081)

前言

土壤中铵态氮和硝态氮是作物的主要氮素来源，两者通过硝化作用和反硝化作用相互转化[1-2]。氮肥主要分为铵态氮肥和硝态氮肥，过量施用氮肥导致农田铵态氮和硝态氮含量超标，影响土壤质量，甚至流失，对周围环境和人体健康带来危害[3-4]。

全波长扫描式多功能读数仪(酶标仪)是在多孔阵列微孔板中加样，由计算机控制，设置特定波长，快速读取微孔板内样品显色后的吸光度，该仪器设备适于大批量样品分析，操作简便。用于土壤浸提液中铵态氮和硝态氮的测定，还缺少深入研究。本研究的目的是采用酶标仪结合比色法分析测定土壤样品中铵态氮和硝态氮含量。旨在建立快速、准确、灵敏的测定土壤铵态氮、硝态氮含量的方法。

1 实验部分

1.1 仪器设备

Varioskan Flash全波长扫描式多功能读数仪(酶标仪，Thermo Scientific公司)、AutoAnalyzer 3连续流动分析仪(SEAL Analytical, ltd.公司)。

1.2 试剂

1.2.1 硝态氮

显色剂：取5.00 g磺胺溶解于300 mL去离子水中，加入0.25 g N-(1-萘基)乙二胺二盐酸盐(C10H7NH2CHCH2NH2·2HCl，NEDD)，并混合均匀，加入50 mL磷酸，稀释定容至500 mL，储存于棕色瓶中。

硫酸铜溶液：称取0.10 g五水合硫酸铜溶于60 mL去离子水中，搅拌溶解后，转移定容至100 mL，摇匀。

硫酸锌溶液：称取1.00 g七水合硫酸锌溶于60 mL去离子水中，搅拌溶解后，转移定容至100 mL，摇匀。

硫酸肼溶液(3.0 g/L)：称取0.6 g硫酸肼(N2H4·H2SO4)完全溶解于120 mL去离子水中，加入2.8 mL硫酸铜溶液和2.0 mL硫酸锌溶液，去离子水定容至200 mL，摇匀。

氢氧化钠溶液：称取16.0 g氢氧化钠，溶解于400 mL水中，混匀。

缓冲溶液：量取6.0 mL磷酸于400 mL去离子水中，加入8.00 g十水二磷酸钠搅拌溶解，用去离子水定容至2 000 mL，混合均匀。

硝酸钾储备溶液(100 mg/L)：称取0.100 0 g硝酸钾溶于600 mL中，去离子水定容至1 000 mL，混匀。

1.2.2 铵态氮

二氯乙氰尿酸钠溶液(连续流动分析仪)：称取4.00 g 氢氧化钠，0.60 g二氯乙氰尿酸钠(C3Cl2N3NaO3，DIC)试剂溶入约120 mL去离子水中，定容至200 mL，混匀。

水杨酸钠溶液：称取8.00 g水杨酸钠溶入约120 mL去离子水中，加入0.20 g硝普钠，定容到200 mL，混匀。

缓冲溶液：称取10.0 g氢氧化钠，7.06 g七水合磷酸氢二钠，31.8 g十二水合磷酸钠溶于约600 mL去离子水中，加入10 mL次氯酸钠，混合均匀，去离子水定容至1 000 mL，混匀。

苯酚溶液(酶标仪)：10.0 g苯酚溶解于约600 mL去离子水中，加入0.10 g硝普钠，搅拌溶解后定容至1 000 mL，混合均匀。

缓冲溶液：称取40 g柠檬酸钠溶解于600 mL水中，定容至1 000 mL，混匀。

氯化铵储备溶液(100 mg/L)：称取0.100 0 g氯化铵溶于约600 mL去离子水中，搅拌溶解后定容至1 000 mL，混合均匀。

氯化钾浸提液：称取74.55 g氯化钾溶于800 mL去离子水中，搅拌溶解，定容至1 000 mL，混匀。

实验中配制试剂时，可根据实际样品量调整试剂配制量，如未特殊说明，所用试剂均为分析纯。

1.2.3 标准溶液的配制

铵态氮标准溶液：分别量取0、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50 mL氯化铵储备溶液，用水定容至50.0 mL，即浓度为0、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mg/L的铵态氮标准溶液。

硝态氮标准溶液：分别量取0、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL硝酸钾储备溶液，用水定容至50.0 mL，即浓度为0、2.00、4.00、6.00、8.00、10.00 mg/L的硝态氮标准溶液。

1.3 实验设计

1.3.1 实验

分别称取10.0 g供试土壤于500 mL具螺旋盖聚乙烯瓶中，加入100 mL氯化钾浸提液，200 r/min室温下震荡1 h，过滤收集滤液。

1.3.2 平行

取6份土壤样品，做与实验组相同的浸提处理，每份土壤做4组平行。通过酶标仪对平行组样品测定，计算标准偏差，分析酶标仪测定铵态氮、硝态氮含量的精密度。

1.3.3 测定

使用AA3连续流动分析仪测定实验组浸提液中铵态氮、硝态氮浓度。

酶标仪测定铵态氮含量：取待测液100 μL加入50 μL缓冲液和50 μL苯酚溶液，避光显色反应1 h后，在625 nm波长下测量吸光度。

酶标仪测定硝态氮含量：取待测液40 μL加入40 μL氢氧化钠溶液和40 μL硫酸肼溶液，封口膜封紧酶标板，反应20 min后，加入80 μL缓冲液和40 μL显色剂在550 nm波长下测定吸光度。

标准曲线测定：分别按照上述试剂加入量用酶标仪测定铵态氮系列标准溶液和硝态氮系列标准溶液的吸光度。

铵态氮加标回收测定：取待测液(6组)50 μL三份，依次加入50 μL 0.20、0.40、0.60 mg/L的铵态氮标准溶液，用酶标仪测定吸光度。

硝态氮加标回收测定：取待测液(6组)20 μL三份，依次加入20 μL 2.00、4.00、6.00 mg/L的硝态氮标准溶液，测定吸光度。计算加标回收率，分析酶标仪测定铵态氮、硝态氮的准确度。

检出限实验：根据12份空白组测定结果，3倍空白标准偏差[16]作为检出限估计值，分析酶标仪测定铵态氮、硝态氮检出限。

2 结果与讨论

2.1 酶标仪法测定的铵态氮和硝态氮标准工作曲线

图1 酶标仪法测定铵态氮标准工作曲线Figure 1 Standard curve of determined by the proposed colorimetric method with a microplate reader.

图2 酶标仪法测定硝态氮标准工作曲线Figure 2 Standard curve of determined by the proposed colorimetric method with a microplate reader.

2.2 酶标仪法测定铵态氮和硝态氮的方法检出限

2.3 酶标仪测定硝态氮过程中还原剂硫酸肼浓度的确定

图3 不同硫酸肼浓度下标准工作曲线Figure 3 Standard curve of measurement with different concentrations of hydrazine sulfate.

2.4 精密度实验

表1 酶标仪测定相对标准偏差

Table 2 Relative standard deviation (RSD) of theproposed colorimetric method with a microplate

样品编号NO-3-N 含量/(mg·L-1)平均值/(mg·L-1)RSD/%13.1993.1073.1573.2353.1751.721.7161.6241.7571.7821.7204.031.7721.7541.6421.6501.7044.041.7051.7651.6121.7821.7164.552.6092.7762.7742.7222.7202.961.7141.7581.7771.6371.7213.6

2.5 酶标仪与连续流动分析仪测定结果比较

图4 连续流动分析仪和酶标仪对含量的测定结果Figure 4 Results of in soil extracts determined by the continuous flow analyzer and the proposed colorimetric method with a microplate reader.

图5 连续流动分析仪和酶标仪对含量的测定结果Figure 5 Results of in soil extracts determined by the continuous flow analyzer and the proposed colorimetric method with a microplate reader.

图6 连续流动分析仪与酶标仪测定结果相关分析Figure 6 Relationship between concentrations in soil extracts determined by the continuous flowanalyzer and theproposed colorimetric method with microplate reader.

图7 连续流动分析仪与酶标仪测定结果相关分析Figure 7 Relationship between concentrations in soil extracts determined by the continuous flow analyzer and the proposed colorimetric method with microplate reader.