人尿源干细胞的分离培养及体外成神经细胞分化研究

姜之歆，王从容

(上海交通大学附属第六人民医院内分泌代谢科，上海市糖尿病研究所，上海市糖尿病重点实验室，上海市糖尿病临床医学中心，上海 200030)

随着组织工程相关研究与日俱增，干细胞治疗越来越被关注[1,2]。干细胞自我更新及体外多向分化能力旺盛，可间接分泌多种细胞因子和调节免疫，常被用来作为治疗疾病的种子细胞，其中用于神经细胞移植疗法的主要有胚胎干细胞(embryonic stem cell，ESC)、神经干细胞(neural stem cell，NSC)以及其他来源的间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)[3-5]。ESC取材不易和伦理问题限制了其广泛应用，NSC需自体有创取材，提取与培养均十分不易。目前已有研究证实骨髓来源的MSC可在体外成功分化为神经细胞[6,7]，在细胞治疗中被广泛研究。人尿源干细胞(human urinary stem cells,hUSC)因便于取材、来源简易、安全无创等特点，临床应用前景广阔[8-10]。Zhang等[11]首次报道从人尿液中分离获得一种具有多向分化潜能的干细胞，并鉴定了其 MSC的生物特性，表达CD29、CD44、CD73、CD90等MSC标志物，并可体外成功分化为脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞等。目前对hUSC分化为神经细胞的相关报道较少，且结果不一。为进一步研究hUSC分化为神经细胞(包括NSC、胶质细胞、神经细胞)的可行性，本研究对既往文献中报道的经典MSC成神经诱导液，以及hUSC成神经诱导液成分做了整合调整，对hUSC向神经类细胞定向分化潜能进行了研究，以期为hUSC在中枢神经系统疾病方面的应用提供新依据。

1 材料与方法

1.1 hUSC的培养和传代

我们收集了3例健康成人无菌新鲜中段尿液200 ml，加入5 ml青链霉素混匀，分装至4管50 ml离心管，400转/min离心10 min后弃上清，加入20 ml磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline，PBS)吹打混匀，继续400转/min离心10 min，弃上清，hUSC培养基重悬后接种于0.1%明胶包被的6孔板中(2 ml/孔)，在37℃、5%CO2培养箱静置培养。hUSC培养基成分包括：含F12 Dulbecco改良型基础培养基(Dulbecco′s modified eagle medium/nutrient mixture F-12,DMEM/F12)、2%胎牛血清、10 ng/ml表皮细胞生长因子(epidermal growth factor，EGF)、2 ng/ml血小板源性生长因子(platelet-derived growth factor,PDGF)、1 ng/ml转化生长因子(transforming growth factor，TGF)、2 ng/ml重组人成纤维细胞生长因子(recombinant human fibroblast growth factor,hFGF)、0.5 mmol/L氢化可的松、24 mg/ml胰岛素、20 mg/ml转铁蛋白、549 ng/ml肾上腺素、125 ng/ml三碘甲状腺原氨酸。原代细胞培养3 d后观察细胞生长情况，并添加培养基1 ml/孔，经7～10 d培养，待hUSC融合率80%～90%时，使用0.25%胰蛋白酶消化传代，用于后续实验。本研究经上海市第六人民医院伦理委员会审核各项通过。

1.2 hUSC表面标志物检测

选取P4 hUSC，PBS洗涤2遍，加入0.25%胰蛋白酶消化，1%牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)洗涤后重悬细胞计数，调整细胞密度至106/ml。取细胞悬液200 μl加入藻红蛋白(phycoerythrin,PE)标记的单克隆抗体CD29、CD73、CD90、CD34和HLA-DR，以及异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)标记的单克隆抗体 CD44、CD31、CD45至各流式管，并以相应的荧光标记的IgG抗体为同型对照组。冰上避光孵育30 min, 孵育后200转/min 离心5 min，使用PBS清洗游离抗体，200转/min 再次离心5 min，最终用1%BSA重悬细胞至200 μl，经Guava easyCyte (Millipore, USA)流式细胞仪检测。

1.3 成神经分化检测

取P4代hUSC，以5×104/ml浓度接种于6孔板，待其融合度达90%～100%时，按预处理、分化诱导两个阶段进行实验。(1)预处理阶段，使用低糖DMEM、10%胎牛血清、100 ng/ml hFGF 预诱导24 h，之后各孔分别更换成对应的诱导液。(2)分化阶段采用不同成分的成神经诱导液诱导14 d。A成神经诱导液是使用经典诱导方案[12]：DF-12培养基，添加50 ng/ml hFGF、50 ng/ml EGF、10 ng/ml 脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor，bDNF)。B成神经诱导液参照既往文献报道的hUSC成神经诱导液成分[13]：DF-12培养基，添加50 ng/ml hFGF、50 ng/ml EGF、2% B27神经细胞培养添加剂、1% 非必需氨基酸(non-essential amino acids，NEAA)、1% L-谷氨酸、1%胰岛素-转铁蛋白-硒(insulin-transferrin-selenium,ITS)溶液。C成神经诱导液在经典诱导方案(A)基础上添加了其他促成神经分化成分，包括0.1%的二甲基亚砜、0.1 mmol/L丁基羟基茴香醚。D成神经诱导液除将DF-12培养基更换为低糖DMEM培养基，其他成分和C成神经诱导液相同。对照组不进行成神经诱导分化。诱导液隔天换液，诱导至第14天时，荧光倒置显微镜下观察各诱导液中细胞形态变化。

1.4 逆转录-聚合酶链反应检测

我们检测了神经干细胞特异性标志物Nestin, 成熟神经细胞特异性标志物β3-tublin与NF-200，胶质细胞前体特异性标志物S100的表达情况。Trizol法常规提取细胞总RNA，cDNA 提取参照Superscript Ⅲ Fast-Strand Synthesis System(Invitrogen) 试剂盒说明。逆转录-聚合酶链反应参照 Powerup Sybr Green Master Mix (Thermo Fischer Scientific) 反应体系，终CT值上机由LightCycler 480 system测得。引物定量标准依据内参GAPDH。引物序列由Primer-BLAST 在线设计获得，由上海生物工程有限公司合成,正反引物如下(表1)。

表1 Nestin、S100、β3-tublin、NF-200、GAPDH基因引物序列

1.5 统计学处理

2 结 果

2.1 hUSC原代培养鉴定

正常人尿液经离心、重悬、接种至6孔板后7～10 d开始出现克隆微团，贴壁生长(图1A)。 细胞紧密排列，形态均一，呈短梭形或米粒样，14 d左右克隆融合率达90%～100%，此时对其进行传代，即得到P1代hUSC(图1B)。细胞增殖迅速，经多次传代，细胞形态未见明显改变(图1C)。

2.2 hUSC的MSC特性

P4代hUSC表面标志物流式细胞术鉴定结果显示，hUSC高表达CD29(99.64%)、CD44(97.22%)、CD73(99.44%)、CD90(71.14%)，不表达CD31(2.66%)、CD34(0.62%)、CD45(2.22%)、HLA-DR(0.60%)，提示其MSC来源具备多向分化潜能 (图2)。

2.3 hUSC细胞诱导分化为神经细胞检测

诱导至第14天时，A成神经诱导液中细胞形态紧密，未发现明显改变(图 3A)，Nestin、S100、β3-tublin、NF-200基因不表达(图 4)。B成神经诱导液中细胞胞体回缩饱满、折光度变强，呈现神经细胞样突起(图 3B)，C成神经诱导液中细胞形态饱满，折光度变强(图 3C)，D成神经诱导液中细胞形态亦出现类似神经细胞样改变(图 3D)。相比A成神经诱导液，B、C和D成神经诱导液中细胞Nestin、S100基因表达水平增高，B和D成神经诱导液中细胞β3-tublin、NF-200基因表达水平降低。其中C成神经诱导液中细胞Nestin基因表达水平高于B和D成神经诱导液中细胞，B成神经诱导液中细胞S100基因表达水平高于C和D成神经诱导液中细胞，差异均具有统计学意义(P<0.05；图 4)。

3 讨 论

hUSC的来源方式简易，可对同一供体进行多次取材，是理想的自体种子细胞来源。既往研究中对hUSC体外诱导多能干细胞后进行成神经分化研究较多，或是通过转导内源性基因建立hUSC来源的NSC模型，进而再向神经细胞分化[12-14]。然而， 直接对hUSC进行体外成神经分化的研究较少,且结果不尽一致。Guan等[15]的研究结果表明hUSC体外成神经分化时NSC特异性标志物Nestin、Sox2表达水平增高，而终末成熟神经细胞标志物如β3-tublin表达水平未增高,提示hUSC可向神经前体细胞分化。Bharadwaj等[16]的研究表明hUSC体外成神经诱导可成功表达NSC特异性标志物Nestin及成熟神经细胞标志物NF-200，但胶质细胞特异性标志物S100表达水平未增高，提示特定培养条件下hUSC可向神经细胞定向分化。

图1 hUSC原代培养

图2 原代hUSC表面标志物流式细胞术鉴定

hUSC: human urinary stem cells. hUSC was identified by flow cytometry using the surface markers CD29,CD44,CD73,CD90,CD31,CD34,CD45 and HLA-DR. White solid peaks represent the isotype controls and the grey solid peak represents the marker indicated.

图3 hUSC 分别在4种成神经诱导液中诱导至第14天时的形态变化

图4 hUSC经4种成神经诱导液诱导至第14天时Nestin、S100、 β3-tublin、NF-200的相对表达水平

本研究结果表明，我们成功从健康成人尿液中提取出hUSC，并鉴定了其MSC来源。在体外成神经分化研究中，A成神经诱导液诱导过程中未见任何细胞形态改变及神经细胞相关基因表达，可能由于MSC来源不同，该诱导液最多报道用于人脐带MSC的成神经分化[13，17]，可能并不适合用于hUSC。成神经诱导液14 d后，B、C、D诱导液中细胞胞体均出现回缩、折光度增加，呈现类似神经样细胞的改变，提示开始向神经细胞转变。逆转录-聚合酶链反应结果显示hUSC经过B、C、D成神经诱导液诱导14 d后，NSC特异性标志物Nestin表达水平均显著上调，其中C成神经诱导液中细胞Nestin表达水平最高(P<0.05)，提示C成神经诱导液最有利于hUSC向NSC分化。B、C、D成神经诱导液中胶质细胞前体标志物S100表达量亦均显著上调，其中B成神经诱导液中细胞S100表达水平最高(P<0.05)，提示B成神经诱导液最有利于hUSC向胶质前体细胞分化。而成熟神经元细胞特异性标志物β3-tublin与NF-200基因在4种成神经诱导液中表达水平未增高，β3-tublin在B、D成神经诱导液中反而有所降低。以上结果初步表明B、C、D成神经诱导液均有助于诱导hUSC向神经类细胞分化，分化的细胞表达NSC特异性标志物Nestin，以及胶质细胞亚群的前体标志物S100，但未能形成成熟的神经细胞。

本研究hUSC成功分化为神经前体细胞，后续实验将从神经前体细胞向成熟神经细胞或成熟神经胶质细胞入手，通过细胞超微结构、神经电生理特性、分子生物学功能等角度进一步验证，hUSC极有可能成为干细胞治疗神经系统疾病的重要“种子细胞”。