乳腺癌患者CYP2D6基因多态性与他莫昔芬代谢相关性研究

陈艳波 孔德嘉 张金锋 马志刚

乳腺癌是女性发病率最高的恶性肿瘤[1]。大约60%的乳腺癌患者为雌激素受体阳性(Estrogen-receptor positive，ER+)的患者，该类乳腺癌依赖雌激素信号刺激肿瘤生长[2]。他莫昔芬(Tamoxifen，TAM)作为选择性雌激素受体调节剂，可以通过对抗肿瘤细胞中的雌激素受体来抑制肿瘤细胞增殖，从而提高乳腺癌患者的生存率[3-4]。在以往的临床治疗中发现，乳腺癌患者对他莫昔芬的反应性存在很大的个体差异，部分患者可能出现耐药现象[5]。但是目前仍然缺少敏感的生物学标志物来预测他莫昔芬的疗效。

已有研究表明，CYP2D6的基因多态性与他莫昔芬在患者体内的代谢和疗效明显相关。因此，本研究在当前的研究中探索CYP2D6的三种基因多态性(rs16947，rs1065852，rs28371725)与他莫昔芬三种代谢产物在患者血液中浓度的相关性，希望本研究能够为后续预测他莫昔芬疗效提供科学依据，从而更加科学的指导临床患者用药。

1 材料与方法

1.1 研究人群

本研究选取2010年1月—2012年12月在哈尔滨医科大学附属肿瘤医院乳腺外科就诊的乳腺癌患者198例，这些患者均通过病理诊断确诊为乳腺癌，并且这些患者在术后应用他莫昔芬进行内分泌治疗。经医生和患者同意后，对病人进行术前采集血液样本，并对血液样本进行下一步检测。

1.2 研究方法

1.2.1 荧光定量PCR基因型鉴定 使用Qiagen公司的DNA提取试剂盒提取外周血DNA，利用NanoDrop2000c仪器定量测定DNA浓度及OD值，质量合格的DNA用0.5 mL EP管分装，-20℃冻存备用。Taqman探针法基因分型：探针在life technology公司订购，荧光定量PCR反应体系如表1。

表1 荧光定量PCR体系及条件Table 1 Reaction system and condition of real time PCR

1.2.2 超高液相色谱仪串联三重四级杆质谱仪检测他莫昔芬三种代谢产物浓度 定量检测TAM三种代谢产物的浓度：4-OH-N-D-TAM、4′OH-N-D-TAM、4-OH-TAM。4-OH-TAM的母离子为388.2，子离子为72.1，锥孔电压为30 V，标准曲线浓度范围为20、40、80、200和600 ng/mL；4-OH-N-D-TAM、4′OH-N-D-TAM的母离子均为374.3，子离子为129，但是保留时间分别为3.7 min和4.2 min，标准曲线浓度范围为50、100、200、500、1000和1500 ng/mL。

1.3 实验质量控制

全部实验在哈尔滨医科大学公共卫生学院分子流行病学实验室完成。所有进行基因分型的DNA样本都通过试剂盒进行提取。实验操作过程在冰盘上操作完成。基因分型使用罗氏荧光定量PCR检测系统。在每96孔板中随机选择1～2个空白对照，每个SNP信号都是在满足形成三个明显分型点聚集簇的情况下，完成基因型分析，并给出报告。对于每个SNP位点，随机选择5%的样本进行复测。

1.4 统计方法

运用SPSS 17.0统计软件进行统计分析，用Shapiro-Wilk法对各组数据进行正态性检验，不符合正态分布，选用Kruskal-Wallis秩和检验，Wilcoxon秩和检验，并进行多重比较检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 液质联用检测他莫昔芬代谢产物

他莫昔芬代谢产物4-OH-TAM的标准曲线为y=0.0013x+8.5298，R2=0.998；他莫昔芬其他两种代谢产物4-OH-N-D-TAM和4′OH-N-D-TAM的标准曲线分别为y=0.042x+9.291，R2=0.9995；y=0.0319x+3.115，R2=0.9975。建立的检测方法具有良好的线性范围和相关系数，能够满足他莫昔芬代谢产物检测的需要。

2.2 SNP位点与他莫昔芬代谢产物浓度的关系

不同基因型患者他莫昔芬代谢产物的浓度经过Shapiro-Wilk法分析后，P值均小于0.05，不符合正态分布。因此，以上数据需采用非参数检验的独立样本Kruskal-Wallis秩和检验Wilcoxon秩和检验进行分析，并用中位数和变异区间进行描述(表2-4)。

2.3 各SNP位点不同基因型携带者他莫昔芬药物代谢浓度的差异

rs16947位点三种基因型之间相比，应用他莫昔芬后产生的4-OH-TAM的浓度并无统计学差异(P=0.704)，而4-OH-N-D-TAM和4′OH-N-D-TAM的浓度均具有统计学差异(P=0.049)。对4-OH-N-D-TAM和4′OH-N-D-TAM两种代谢产物在各基因型组间的差异进行两两比较，经多重检验校正后发现，纯合变异型和纯和野生型之间相比，代谢产物浓度具有统计学差异(P=0.014)，AG及GG基因型之间相比，同样具有统计学差异(P=0.008)。以上结果表明该位点不同基因型与代谢产物4-OH-N-D-TAM和4′OH-N-D-TAM在血液中浓度有关，因此该SNP位点可能参与了患者他莫昔芬的代谢过程(表5)。

此外，rs1065852位点和rs28371725位点上的变异与代谢产物4-OH-N-D-TAM、4′OH-N-D-TAM和4-OH-TAM的含量均无统计学差异，表明这些SNP位点的多态性并未参与他莫昔芬的代谢过程。

表2 rs16947不同基因型携带者他莫昔芬代谢产物的浓度(ng/mL)Table 2 The metabolites concentrations(ng/mL)of Tamoxifen in different genotypes of rs16947(ng/mL)

Note：*Pvalue stands for normality test，P<0.05 does not conform to normal distribution.

表3 rs1065852不同基因型携带者他莫昔芬代谢产物的浓度(ng/mL)Table 3 The metabolites concentrations(ng/mL)of Tamoxifen in different genotypes of rs1065852(ng/mL)

Note：*Pvalue stands for normality test，P<0.05 does not conform to normal distribution.

表4 rs28371725不同基因型携带者他莫昔芬代谢产物的浓度(ng/mL)Table 4 The metabolites concentrations(ng/mL)of Tamoxifen in different genotypes of rs28371725(ng/mL)

Note：*Pvalue stands for normality test，P<0.05 does not conform to normal distribution.

表5 rs16947不同基因型间他莫昔芬代谢产物浓度的比较分析Table 5 The correlation among the metabolites concentrations(ng/ml)of Tamoxifen in different genotypes of rs16947

3 讨论

内分泌治疗是ER阳性乳腺癌患者治疗的重要组成部分，他莫昔芬作为内分泌治疗药物已有30年的历史，现在仍然是该亚型患者辅助治疗的标准药物，可以降低患者复发和死亡风险。在临床治疗过程中，仅仅约50%的患者对他莫昔芬治疗有所获益，严重影响了患者的预后。他莫昔芬的代谢过程在肝脏中进行，经过P450 3A4/5和CYP2D6介导，形成N-去甲基TAM(N-desmethyl tamoxifen，NDM-TAM)，4-羟基TAM(4-Hydroxy tamoxifen，4-OH-TAM)和4-羟基-N-去甲基TAM(4-Hydroxy-desmethyl tamoxifen，4-OH-N-D-TAM)三种代谢产物，这些代谢产物与ER的亲和力明显提高，可以更显著的抑制ER阳性乳腺癌细胞的增殖[6-8]。

CYP2D6是他莫昔芬代谢过程中的一种关键酶，研究显示，CYP2D6存在约100种基因突变位点，这些突变与他莫昔芬代谢活性明显相关，进而导致乳腺癌患者对他莫昔芬反应出现明显差异[9-11]。根据CYP2D6等位基因的不同变异和组合，将患者分为4组代谢表型：低代谢型(Poor metabolizers，PMs)、中间代谢型(Intermediate metabolizers，IMs)、泛代谢型(Extensive metabolizers，EMs)和超速代谢型(Ultrarapid metabolizers，UMs)[12]。有研究表明，给予乳腺癌细胞他莫昔芬时，活性代谢产物4-OH-N-D-TAM的浓度在IMs和EMs中比较高，其对乳腺癌细胞的抑制效果也更好[13]。因此，CYP2D6不同位点的变异可以影响他莫昔芬的活性和疗效。

CYP2D6基因多态性个体差异显著，欧美国家最常见的是CYP2D6*4，而亚洲人群最主要的变异体为CYP2D6*10[14]。研究表明CYP2D6*3、CYP2D6*4、CYP2D6*5、CYP2D6*6的杂合子或纯合子可以影响乳腺癌患者4-OH-N-D-TAM的浓度[15]。Xu等发现携带CYP2D6*10等位基因*10/*10的患者，其血中4-OH-N-D-TAM的水平较低[16]。

多项研究表明，CYP2D6基因多态性与他莫昔芬的体内代谢相关，进而可能会对乳腺癌患者的生存产生影响，但由于研究位点不同，研究结果间存在一定的争议。如Okishiro等[17]分析发现CYP2D6基因多态性与乳腺癌患者的无病生存率无相关性，Rae也得到了相似的结果，对他莫昔芬治疗的乳腺癌患者随访10年，结果表明CYP2D6基因型与患者无病生存率无相关性[18]。而一项Meta分析表明，在使用他莫昔芬的乳腺癌患者中，不同的CYP2D6基因型会影响患者的生存[19]。因此，进行大样本、多中心的研究可能会为临床用药提供更可靠的依据。

我国乳腺癌疾病的现状表明，雌激素受体阳性的患者占所有乳腺癌患者的60%～70%，针对雌激素受体阳性的患者进行的内分泌治疗，成为全身治疗的重要手段，他莫昔芬可以广泛应用于雌激素受体阳性的患者，因此，近年来针对于CYP2D6基因多态性与他莫昔芬代谢及疗效的研究受到了广泛的关注。由于CYP2D6活性下降，有可能引起他莫昔芬疗效下降，针对当前实验，研究CYP2D6与该基因SNP位点的相关性就变得尤为重要。本实验分析了乳腺癌患者CYP2D6三个SNP位点(rs16947，rs1065852，rs28371725)基因型和他莫昔芬血液中药物代谢产物浓度之间的关系。实验结果表明，CYP2D6基因的SNP rs16947与4-OH-N-D-TAM和4′OH-N-D-TAM在血液中的浓度相关。因此，该位点可能参与了他莫昔芬在体内代谢的过程，在乳腺癌患者使用他莫昔芬前，检测分析CYP2D6基因型以及其相应的代谢类型，预测他莫昔芬的疗效，对指导临床患者他莫昔芬用药具有重要意义。

目前关于CYP2D6基因与ER阳性乳腺癌患者他莫昔芬治疗的预后尚存争议，所以，需要针对大样本量及长期随访的实验数据，分析其对患者预后的影响，以期望能够指导ER阳性乳腺癌患者进行精准的内分泌治疗，提高患者的内分泌治疗效果。