片仔癀对四氯化碳诱导肝纤维化大鼠肝功能及核因子-κB蛋白表达的影响

郑海音 华丽萍 张玉琴 王晓颖 徐伟

摘要：目的  观察片仔癀对CCl4诱导的肝纤维化大鼠肝功能和核因子-κB（NF-κB）蛋白表达的影响，探讨其作用机制。方法  将24只大鼠随机分为正常对照组、模型组、片仔癀组、秋水仙碱组，每组6只，50%CCl4灌胃8周制备肝纤维化模型。末次给药1 h后，血清测定ALT、AST、Ⅲ型前胶原、Ⅳ型胶原、层黏连蛋白和透明质酸含量，取肝脏计算肝指数，HE染色和VG染色观察肝组织病理形态，Western blot检测NF-κB蛋白表达。结果  与正常对照组比较，模型组大鼠肝指数及ALT、AST、Ⅲ型前胶原、Ⅳ型胶原、层黏连蛋白、透明质酸含量和NF-κB蛋白表达明显升高（P<0.01）;与模型组比较，各给药组大鼠肝指数及ALT、AST、Ⅲ型前胶原、Ⅳ型胶原、层黏连蛋白、透明质酸含量和NF-κB蛋白表达均明显降低（P<0.01）。结论  片仔癀对CCl4所致肝纤维化大鼠具有保护作用，其机制可能与抑制NF-κB的表达有关。

关键词：片仔癀;肝纤维化;核因子-κB;大鼠

中图分类号：R285.5    文献标识码：A    文章编号：1005-5304（2019）04-0057-04

维状结构为特征，纤维疤痕破坏正常肝结构而影响肝功能最后导致肝衰竭[1-2]。肝纤维化的进展往往与肝硬化及肝癌有关[3-4]。肝纤维化虽可逆，但由于对病因及发病机制缺乏全面深入了解，至今临床上未有上市的抗肝纤维化药物[5]。近年来，中药复方在干预肝纤维化方面作用显著[6-7]。片仔癀由三七、麝香、牛黄、蛇胆等中药组成[8]，有散瘀止血、消肿定痛的功效。有研究表明，片仔癀对肝纤维化和慢性肝损伤有一定的保护作用[9-11]。因此，本研究在上述基础上，观察片仔癀对CCl4诱导的肝纤维化大鼠肝功能和核因子-κB（NF-κB）蛋白表达的影响，探讨其作用机制。

1  实验材料

1.1  动物

SPF级雄性SD大鼠24只，体质量（250±20）g，福建中医药大学动物实验中心，动物许可证号SCXK（沪）2017-0005。飼养于福建中医药大学动物实验中心SPF级动物房，温度21～23 ℃，相对湿度55%～75%，12 h昼夜循环。适应性饲养5 d后用于实验。

1.2  药物

片仔癀，漳州片仔癀药业公司，批号1703024;秋水仙碱片，西双版纳药业有限公司，批号170306。

1.3  主要试剂与仪器

CCl4，国药集团化学试剂有限公司，批号20151109;花生油，鲁花集团，批号20170325;水合氯醛，源叶生物科技有限公司，批号Z03D6Y7011;细胞裂解液、PMSF，碧云天生物技术有限公司，批号P00013B、ST506;ALT、AST试剂盒，南京建成生物工程研究所，批号20180117、20180118;大鼠透明质酸（HA）、层黏连蛋白（LN）、Ⅲ型前胶原肽C端、Ⅳ型胶原ELISA试剂盒，上海西塘生物技术有限公司，批号分别为1803201、1804202、1803202、1804162。台式冷冻离心机（美国贝克曼库尔特公司），多功能酶标仪（奥地利Infinite公司），光学显微镜（德国LEICA公司），Mini-protean 3型垂直电泳槽（美国Bio-Rad公司），ChemiDoc XRS+凝胶成像分析系统（美国Bio-Rad公司）。

2  实验方法

2.1  造模及给药

根据文献[12]及预实验确定造模方法和给药剂量。大鼠随机分为正常对照组、模型组、片仔癀组、秋水仙碱组，每组6只。除正常对照组外，其余3组均给予CCl4花生油（1∶1）1 mL/kg灌胃，每周2次，共8周。造模同时，片仔癀组和秋水仙碱组予相应药物灌胃。除正常对照组外，均予高脂饲料。片仔癀给药量为0.15 g/100 g，秋水仙碱给药量为0.1 mg/100 g。给药体积0.5 mL/100 g，1次/d，连续8周。

2.2  取材

实验期间每周大鼠称重2次。末次给药前，禁食不禁水24 h。取材前，10%水合氯醛0.35 mL/100 g腹腔注射麻醉，腹主动脉取血。取血完成后，立即解剖取肝脏，用于HE染色和Western blot检测。

2.3  肝脏检测

称取肝脏质量，计算肝指数。肝指数（%）=肝脏湿重÷体质量×100%，随后用相机对每组大鼠肝脏同一条件进行拍照，观察肝脏形态。

2.4  HE染色

取同一部位0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm肝组织，4%多聚甲醛浸泡，固定24 h，石蜡切片，二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱二甲苯，水洗，HE染色15 min，水洗，1%盐酸乙醇镜检分化，乙醇脱水，中性树胶封固。

2.5  VG染色

4%多聚甲醛固定肝组织，石蜡切片，常规脱蜡至水，95%乙醇稍洗，盐酸乙醇分化，VG染色12 min，95%乙醇分化脱水，二甲苯透明，中性树胶封固镜检。

2.6  血清指标检测

将血离心获得血清，用ALT、AST试剂盒和大鼠HA、LN、Ⅲ型前胶原肽C端免疫检测试剂盒、Ⅳ型胶原ELISA定量检测试剂盒进行测定。

2.7  Western blot检测

取肝组织，4 ℃冰浴，以1∶10比例（0.1 g肝组织∶1 mL裂解液）加入裂解液彻底研磨，12 000 r/min，离心5 min，取上清液，用BCA试剂盒进行蛋白含量的测定，按一定比例加入5×loading Dye，100 ℃变性10 min后，上样，电泳，PVDF转膜，5%脱脂奶粉封闭 2 h，TBST清洗3次×10 min，孵育一抗（NF-κB 1∶1000），4 ℃摇床过夜。第2日，TBST清洗3次×10 min，孵育二抗（1∶5000）2 h，TBST清洗，显影。以GAPDH为内参，用Image Lab计算光密度值。

3  统计学方法

采用SPSS21.0统计软件进行分析。实验数据以x（—）±s表示，组间比较用方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。

4  结果

4.1  片仔癀对肝纤维化大鼠体质量的影响

在实验8周内，正常对照组大鼠体质量匀速增长，精神状态良好;模型组第1次造模后均出现较大幅度体质量持续降低，且精神低迷，活动力下降，持续约2周，第3周起，各组体质量持平并开始增加，但增幅与正常对照组相比较迟缓，活动力得到一定好转但明显迟缓于正常对照组;各给药组大鼠精神状态及毛发亮泽均有一定程度的好转。见表1。

4.2  片仔癀对模型大鼠肝脏形态的影响

正常对照组大鼠肝脏颜色红润，表面光滑，质地柔软;模型组大鼠肝脏明显肿大，呈黄褐色，表面粗糙呈颗粒状;片仔癀组和秋水仙碱组大鼠较模型组肝脏肿大均有一定程度的降低，表面光滑及颜色有一定好转，更接近正常对照组大鼠肝脏形态。见图1。

4.3  片仔癀对模型大鼠肝指数的影响

与正常对照组比较，模型组大鼠肝指数显著升高（P<0.01）;与模型组比较，片仔癀组和秋水仙碱组大鼠肝指数均显著降低（P<0.01）。见图2。

4.4  片仔癀对模型大鼠肝组织病理形态的影响

HE染色结果显示，正常对照组大鼠肝组织形态正常;模型组大鼠肝细胞大量脂肪变性，炎性细胞浸润，大量纤维结缔组织增生，正常肝小叶结构被破坏，甚至出现肝小叶结构重新构建;片仔癀组和秋水仙碱组大鼠肝细胞脂肪变性明显减少，炎性细胞水平显著降低，纤维增生程度明显减轻，但未恢复至空白对照组的正常水平。VG染色结果显示，胶原纤维深粉色，与正常对照组比较，模型组大鼠胶原纤维明显增多，肝小叶结构受到破坏，各给药组大鼠肝纤维化呈现一定程度的好转。见图3。

4.5  片仔癀对模型大鼠血清相关因子的影响

与正常对照组比较，模型组大鼠血清ALT、AST、Ⅳ型胶原、Ⅲ型前胶原、HA和LN均显著升高（P<0.01）;与模型组比较，片仔癀组和秋水仙碱组大鼠血清ALT、AST、Ⅳ胶原、Ⅲ型前胶原、HA和LN均显著降低（P<0.01）。见图4～图6。

4.6  片仔癀对模型大鼠核因子-κB蛋白表达的影响

与正常对照组比较，模型组大鼠肝组织NF-κB蛋白表达明显升高（P<0.01）;与模型组比较，片仔癀组和秋水仙碱组大鼠肝组织NF-κB蛋白表达明显降低（P<0.01）。见图7。

5  讨论

肝纤维化是多种原因引起的慢性肝损害所致的病理改变，表现为肝内ECM过度异常地沉积，并影响肝脏的功能。肝纤维化最终会导致终末期肝硬化和肝细胞癌，同时严重影响患者的生活质量。CCl4诱导的肝纤维化模型是现阶段最为常见的肝纤维化模型。本实验以CCl4构建肝纤维化大鼠模型为基础，进行其作用及机制研究。结果表明，模型组大鼠肝脏出现不同程度肿大，血清ALT、AST、HA、LN、Ⅲ型前胶原、Ⅳ型胶原等指标明显升高，表明模型大鼠肝功能遭到严重的损伤以及纤维化，而给予片仔癀治疗后，这些指标明显改善，说明片仔癀对肝纤维化有较好的保护作用。

NF-κB是一种多功能的核转录因子，几乎存在于所有细胞中，它调控多种细胞因子的表达，从而调节多种生理病理过程，如炎症、细胞凋亡等，在肝脏炎症、肝纤维化及肝细胞再生中都担任重要的角色。它以同构或异构二聚体形式存在，其中p65和p50是普遍存在的异源二聚体，控制着大多数NF-κB上调基因的表达。近年来大量实验表明，NF-κB参与肝纤维化的增殖与凋亡，它上调肿瘤坏死因子-α，诱导肝星状细胞的活化，从而引起肝纤维化[9-10]。本实验结果显示，模型组大鼠NF-κB表达量显著升高，片仔癀干预可显著降低大鼠肝组织NF-κB的蛋白表达。

综上，片仔癀可明显降低肝纤维化大鼠肝脏NF-κB的表达，起到抗肝纤维化的作用。目前临床上尚缺乏确实有效的药物，特异性抗肝纤维化的药物研发还处于初始阶段，加快中药抗肝纤维化的研究进程十分必要。

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（收稿日期：2018-08-10）

（修回日期：2018-09-12;編辑：华强）