PTEN基因沉默对小鼠原代肝细胞Akt/GSK-3β信号通路的影响*

周 龙，王立林，胡序怀，李亚文

(1.广东省深圳市卫生健康发展研究中心 518000；2.南方医科大学附属深圳妇幼保健院麻醉科，广东深圳 518000；3.广东省深圳市血液中心 518000)

胰岛素抵抗可严重影响危重患者的预后[1-2]，丙泊酚是目前临床上最常用的静脉麻醉药，广泛用于危重患者的镇静或麻醉。丙泊酚可导致大鼠全身胰岛素抵抗[3]，但其分子机制尚不清楚。笔者前期研究已经发现，丙泊酚可引起小鼠原代肝细胞蛋白激酶B(Akt)和糖原合酶激酶-3β(GSK-3β)磷酸化水平降低，抑制小鼠原代肝细胞磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/Akt/GSK-3β信号通路，抑制小鼠原代肝细胞糖原合成，从而引起小鼠原代肝细胞胰岛素抵抗[4]。第10号染色体缺失性磷酸酶-张力蛋白同源物蛋白(PTEN)可从上游调节PI3K/Akt信号通路[5-7]，在先前研究的基础上[4]，笔者推测PTEN参与了丙泊酚所致的胰岛素抵抗。本实验将通过基因沉默，探讨PTEN对小鼠原代肝细胞Akt/GSK-3β信号通路的影响，旨在评估研究丙泊酚所致胰岛素抵抗分子机制时PTEN是否为一个值得验证的对象，为进一步探索丙泊酚引起胰岛素抵抗的分子机制提供实验依据。

1 材料与方法

1.1材料 siRNA-996、阴性对照siRNA(上海吉玛基因公司)。siRNA-996序列：5′-GGU GUA UAC AGG AAC AAU ATT-3′(正义链)，5′-UAU UGU UCC UGU AUA CAC CTT-3′(反义链)；阴性对照siRNA序列：5′-UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTT-3′(正义链)，5′-ACG UGA CAC GUU CGG AGA ATT-3′(反义链)。细胞培养试剂(美国Invitrogen公司)，十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)试剂(美国Bio-Rad Laboratories公司)，HiPerFect转染试剂盒(德国Qiagen公司)，Akt、磷酸化Akt(p-Akt)、GSK-3β、磷酸化GSK-3β(p-GSK-3β)、兔抗PTEN抗体(美国Cell Signaling Technology公司)，聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(美国Millipore公司)。雄性C57BL/6小鼠(8周龄，22～32 g)由北京大学医学部实验动物科学部提供[许可证号：SCXK(京)2016-0010]。

1.2方法

1.2.1细胞培养 采用两步胶原酶灌注法分离小鼠原代肝细胞[8-9]，1只小鼠能提供5×107～5×108个原代肝细胞，收集细胞于50 mL离心管中，800 r/min离心8 min，弃上清液，用细胞培养基重新悬浮，显微镜下台盼蓝染色观察活细胞，细胞计数，调整细胞密度，以适当浓度接种培养瓶，于37 ℃含5% CO2的培养箱中培养。

1.2.2实验分组 阴性对照组(NC-C组)：小鼠原代肝细胞中加入阴性对照siRNA(终浓度50 nmol/L)。阴性对照siRNA与siR-996有基本相同的碱基组成，但与靶mRNA无同源性。阴性对照siRNA进入细胞后不会引起基因表达的改变，能够反映siRNA进入细胞后对基因表达的非特异影响。阴性对照IL-6组(NC-IL组)：NC-C组的基础上加入IL-6(终浓度10 ng/mL)，用于检测IL-6对Akt和GSK-3β磷酸化水平的影响。以及IL-6对PTEN蛋白表达的影响。siR-996对照组(996-C组)：小鼠原代肝细胞中加入siRNA-996(终浓度50 nmol/L)；siR-996与IL-6组(996-IL组)：小鼠原代肝细胞中加入siRNA-996和IL-6。

1.2.3细胞转染 在转染的前1 d对小鼠原代肝细胞换液，计数活细胞，调整细胞密度，置于37 ℃含5% CO2的培养箱中培养。按照HiPerFect试剂说明书，在24孔板中加入小鼠原代肝细胞(6×104个/孔)，用DMEM培养液(含100 U/mL青霉素、10%胎牛血清)稀释至500 μL，置于37 ℃含5% CO2的培养箱中。用无血清的DMEM培养液稀释75 ng siRNA至5 nmol/L(终浓度)，然后加入3 μL HiPerFect转染试剂，室温下静置10 min，将混合物缓慢加入培养皿中，混匀，置于37 ℃含5% CO2培养箱中培养24 h。

1.2.4蛋白检测 用10% SDS-PAGE分离细胞裂解液，再将其转移到PVDF膜上，用5%脱脂奶粉室温下封闭1 h。加入一抗(以1∶1 000的浓度稀释)，在摇床上缓慢摇动，孵育3 h，如果一抗在室温下孵育效果不佳，可以改为在4 ℃下过夜；TBS-T洗膜，室温振摇5 min，共洗涤3次，如果结果背景亮度较高可适当延长洗涤时间或增加洗涤次数。洗膜后加入以辣根过氧化物酶标记的相应二抗(以1∶3 000的浓度稀释)，与膜共同孵育1 h，TBS-T洗膜，室温振摇5 min，共洗涤5次。在暗室中加入等体积混合发光缓冲液，均匀滴加到PVDF膜的蛋白面上，压X光胶片1～10 min；显影、定影，用Gel-Pro Analyzer分析蛋白条带灰度。

2 结 果

2.1Akt磷酸化水平 与NC-C组相比，NC-IL组Akt磷酸化水平降低(P<0.05)，996-C组和996-IL组Akt磷酸化水平升高(P<0.05)，见图1A、B。

2.2GSK-3β磷酸化水平 与NC-C组相比，NC-IL组GSK-3β磷酸化水平降低(P<0.05)，996-C组和996-IL组GSK-3β磷酸化水平升高(P<0.01)，见图1A、C。

A：Western blot分析的蛋白条带；B：IL-6和PTEN基因沉默对Akt磷酸化水平的影响；C：IL-6和PTEN基因沉默对GSK-3β磷酸化水平的影响；D：IL-6和PTEN基因沉默对PTEN蛋白表达的影响；*：P<0.05，#：P<0.01，与NC-C组比较；△：P<0.05，与996-C组比较

图1 PTEN对小鼠原代肝细胞Akt/GSK-3β信号通路的影响

2.3PTEN蛋白水平 与NC-C组相比，NC-IL组PTEN蛋白水平升高(P<0.05)，996-C组和996-IL组PTEN蛋白水平降低(P<0.01)，996-IL组PTEN蛋白水平高于996-C组(P<0.05)，见图1A、D。

3 讨 论

IL-6是一种常见的细胞因子，有研究发现在NCTC-1469细胞中IL-6可抑制Akt/GSK-3β信号通路，抑制糖原合成，引起NCTC-1469细胞胰岛素抵抗[10]。IL-6可通过诱导胰岛素受体底物-1(IRS-1)降解或增加IRS-1丝氨酸磷酸化来抑制胰岛素信号通路[11]。在本实验中IL-6使小鼠原代肝细胞Akt磷酸化水平和GSK-3β磷酸化水平都降低，表明IL-6可抑制小鼠原代肝细胞Akt/GSK-3β信号通路。

PTEN于1997年被发现，是人类发现的第1个具有磷酸酶活性的抑癌基因，其编码的蛋白在细胞质中表现出双重特异性磷酸酶活性，PTEN在细胞凋亡、细胞迁移、细胞周期阻滞过程中起关键性作用[12-13]。PTEN蛋白能够募集到细胞膜上行使脂质磷酸酶作用，还能使多种蛋白质磷酸化，从而干预多条信号途径转导，它还能在细胞核中对基因转录进行调控[14-15]。PTEN是PI3K/Akt信号通路的重要调节基因，结合到质膜上的PTEN可将3,4,5-三磷酸磷脂酰肌醇(PIP3)催化为4,5-二磷酸磷脂酰肌醇(PIP2)，从而抑制PI3K/Akt信号转导[16]。本研究发现，在小鼠原代肝细胞中IL-6可引起PTEN蛋白表达增强，进而抑制小鼠原代肝细胞Akt和GSK-3β磷酸化，从而抑制Akt/GSK-3β信号通路。而在小鼠原代肝细胞中PTEN基因沉默可抑制PTEN蛋白表达，使小鼠原代肝细胞Akt磷酸化水平和GSK-3β磷酸化水平都升高，显示PTEN基因沉默可增强小鼠原代肝细胞Akt/GSK-3β信号通路转导。此外，PTEN基因沉默还可逆转IL-6所致的PTEN蛋白表达水平升高，使原本受IL-6抑制的Akt和GSK-3β磷酸化水平恢复到比抑制前更高的水平，表明PTEN基因沉默可逆转IL-6对小鼠原代肝细胞Akt/GSK-3β信号通路的抑制。

综上所述，PTEN基因沉默可增强小鼠原代肝细胞Akt/GSK-3β信号通路转导，并可逆转IL-6对小鼠原代肝细胞Akt/GSK-3β信号通路的抑制，在研究丙泊酚引起胰岛素抵抗的分子机制时PTEN是一个值得验证的作用靶点。