丹参凝集素促进血管平滑肌细胞的增殖机制研究*

沈艳花，牛成群，覃韦宁，李 珊，武福云

(湖北医药学院基础医学院，湖北十堰 442000)

血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)位于血管中膜，是构成血管壁组织结构及维持血管张力的主要细胞，并且在多种生理过程中发挥重要作用。VSMCs的增殖分化与血管发育、血管损伤修复和血管重塑等密切相关[1]。而异常的VSMCs增殖可造成许多病理性损伤，如动脉粥样硬化、血管成形术后再狭窄和高血压血管重塑等心血管疾病[2-4]。中草药在治疗心血管疾病方面具有独特的优势，如益气活血化瘀的中药丹参[5]。丹参的主要提取物包括脂溶性的丹参酮和水溶性的丹酚酸类[6]。以往研究表明，丹参酮能够抑制VSMCs增殖，具有抗动脉粥样硬化的作用，而丹酚酸对VSMCs及内皮细胞具有保护作用[7-8]。除此之外，中草药活性蛋白在心血管疾病方面的作用也得到了重视，但是如何保证分离纯化蛋白的纯度及活性至关重要[9]。利用蛋白质纯化及质谱鉴定技术笔者得到了具有生物活性的丹参凝集素蛋白(SMLP)，并研究了其对大鼠VSMCs增殖的影响，以及利用丹参基因组已经测序这一优势，获得丹参凝集素基因，并利用蛋白质原核表达系统在体外表达纯化有功能的SMLP，为进一步研究丹参凝集素的功能、其促进VSMCs增殖的机制及在其他领域的应用提供基础。

1 材料与方法

1.1材料 中药丹参购自药店，并经湖北医药学院鉴定。大鼠VSMCs A7r5购自上海慧颖生物科技有限公司，抗体购自武汉三鹰生物技术公司。分子克隆相关试剂：DNA聚合酶、限制性内切酶及T4 DNA连接酶购自日本TaKaRa公司，感受态细胞Trans I-TI、BL21购自全式金生物技术公司。蛋白表达相关试剂：LB培养基、卡那霉素、诱导剂异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)购自上海生工。蛋白纯化相关试剂：镍柱(Ni NTA beads)、阴离子交换柱及分子筛购自美国GE公司。

1.2方法

1.2.1丹参蛋白的提取分离 丹参药材经粉碎后，按照1∶5(g/mL)加入磷酸盐缓冲液(PBS)，4 ℃浸泡24 h后，4 ℃，5 000×g离心10 min后将上清液转移到浓缩管，浓缩后，经分子筛superdex 200分离，并利用阴离子交换柱进一步分离得到目的蛋白，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测分离纯化后的蛋白，并用于后续的质谱鉴定。

1.2.2噻唑蓝(MTT)实验 以3 000个/孔的细胞密度将A7r5细胞接种于96孔板，设置3个复孔。培养箱培养12 h，使细胞贴壁。实验组每孔加入不同浓度的丹参凝集素蛋白，继续培养24 h，每孔加10 μL的MTT(5 g/L)继续培养4 h，弃上清液，加150 μL的二甲基亚砜(DMSO)，振荡5 min，使MTT结晶完全溶解，以空白对照孔调零，酶联免疫检测分析仪测定490 mm处的吸光度值(A值)，各复孔A值的平均值作为统计数据，所检测的A值的大小可反映活细胞数量。MTT实验至少重复3次。

1.2.3免疫印迹法(Western blot) 对照组和SMLP处理组细胞用RAPA裂解液裂解后，二喹啉甲酸(BCA)法测蛋白浓度，利用SDS-PAGE分离蛋白，并将蛋白转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%奶粉封闭1 h后，加入一抗4 ℃孵育过夜，Tris缓冲盐-吐温溶液(TBST)洗膜后，二抗孵育2 h，显色。

1.2.4pet-28a-sml原核表达载体构建 以丹参为材料，抽提其叶片总RNA，利用反转录PCR(RT-PCR)的方法得到其cDNA第一链。以cDNA为模板，通过PCR的方法体外扩增出丹参凝集素基因sml，通过NheI和XhoI限制性内切酶及T4 DNA连接酶将sml基因插入到原核表达载体pet-28a，转化感受态细胞DH5α，提质粒送武汉擎科生物公司测序，确认序列正确，引物合成及质粒测序由武汉擎科生物公司完成。所用上下游引物中正向：5′-CTA GCT AGC ATG GCC AAC CTT CCC CAA AC-3′；反向：5′- CCG CTC GAG TCA AAT CTG CTT AAG GCT GAC-3′。

1.2.5蛋白表达及纯化 取测序正确的pet-28a-sml质粒转化表达蛋白的感受态细胞BL21，将菌接种到LB培养基，并加入卡那霉素(50 μg/mL)，37 ℃振荡培养至A值达到0.8，加入终浓度为0.5 mmol/L的诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，24 ℃诱导12 h后，5 000 r/min离心15 min收集菌体，超声破碎后12 000×g离心30 min，收集上清液与镍柱结合，Wash buffer(50 mmol/L Tris-HCl pH 8.0，200 mmol/L NaCl，20 mmol/L咪唑)洗掉非特异结合的蛋白，Elution buffer(50 mmol/L Tris-HCl pH 8.0，200 mmol/L NaCl，500 mmol/L咪唑)将凝集素蛋白从镍柱上洗脱下来，经离子交换柱进一步纯化后，浓缩到5 mg/mL，并过滤除菌，用于后续细胞实验或冷冻于-80 ℃保存。

1.2.6红细胞凝集实验 制备2%小鼠红细胞悬液，吸取少许滴两滴到干净的玻片上，分别加入PBS和0.6 μmol/L SMLP，2 min后观察红细胞凝集的结果。

2 结 果

2.1丹参活性蛋白的分离 将中药丹参粉碎后，用PBS浸提丹参蛋白后，将总蛋白经过分子筛分离，得到3个主要的组分P1、P2和P3。将这3个组分经SDS-PAGE分离后，得到了一个相对分子质量25×103左右，并且含量较多的蛋白，见图1A。为进一步纯化该蛋白，将P1组分继续通过阴离子交换柱，得到了纯化的丹参蛋白，见图1B。

A：分子筛分离丹参蛋白电泳分析；B：阴离子交换柱分离蛋白电泳分析

图1 丹参蛋白的分离纯化及电泳分析

2.2丹参活性蛋白的鉴定 采用质谱鉴定纯化的丹参活性蛋白，并与丹参基因组数据库比对得到该蛋白的氨基酸序列，见图2A。使用美国国立生物技术信息中心(NCBI)数据库的Blast功能进行蛋白质序列比对，得出该蛋白是一种L型的植物凝集素，将该蛋白称为SMLP。

2.3SMLP素促进VSMCs增殖 为检测SMLP对VSMCs的增殖作用，将从丹参中分离纯化的SMLP加入到A7r5细胞培养液中，处理24 h后，利用MTT实验检测细胞的增殖率。结果表明，SMLP能够明显促进VSMCs的增殖，见图3A。为进一步确认SMLP对A7r5细胞的促增殖作用，利用Western blot检测增殖相关基因蛋白激酶B(AKT)基因与哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)总蛋白表达水平，以及二者的磷酸化水平，见图3B；同时，检测凋亡相关基因JNK1和Bax，见图3C。结果表明，SMLP能够促进ATK及mTOR的磷酸化，磷酸化AKT(p-AKT)和磷酸化mTOR(p-mTOR)水平升高，总ATK及mTOR未发生明显变化，而相关凋亡基因的表达水平被抑制。

A：丹参活性蛋白的氨基酸序列；B：蛋白质序列比对

图2 丹参活性蛋白质谱鉴定

A：MTT实验检测SMLP对A7r5细胞的增殖作用；B：不同浓度SMLP处理细胞后AKT、mTOR及其磷酸化水平；不同浓度SMLP处理细胞后凋亡相关基因JNK1和Bax的变化水平；*：P<0.05，#：P<0.01

图3 SMLP促进VSMCs增殖

A：PCR扩增丹参凝集素基因sml；B：双酶切验证sml基因插入到原核表达载体pet-28a；泳道1：未经酶切的重组质粒；泳道2：酶切之后的重组质粒；C：体外表达纯化SMLP；M：蛋白标志物

图4 SMLP的原核表达载体构建及蛋白表达纯化

2.4SMLP的原核载体构建及蛋白表达纯化 丹参是首个基因组测序的中草药，利用这一优势，构建了丹参凝集素基因的原核表达载体。通过PCR的方法体外扩增出丹参凝集素基因sml，见图4A；通过酶切连接的方法将sml基因插入到原核表达载体pet28a，经双酶切验证，成功构建了pet28a-sml载体，见图4B；经测序确认序列正确后，将其转化至感受态细胞BL21，诱导表达带有His标签的SMLP，纯化后得到了高纯度的SMLP，见图4C。

2.5SMLP活性检测 为分析体外表达纯化的丹参凝集素蛋白是否具有功能，检测其凝集红细胞的功能。结果显示，左侧红细胞悬液加入PBS，红细胞均匀分散，并无凝集；右侧红细胞悬液加入纯化的凝集素蛋白SMLP，红细胞凝集成块，颜色加深，见图5。

图5 SMLP血细胞凝集实验

3 讨 论

目前，中草药小分子化合物的分离鉴定取得了很大的进展，多种小分子被应用于抗肿瘤及心血管疾病的治疗，包括生物碱类、甙类、酮类、萜类和挥发油类等[10]。但是，中草药中除了这些重要的次生代谢产物外，还存在很多活性蛋白，它们的重要性往往被忽视。主要原因是从中草药中提纯蛋白质有一定的难度。如何在提取过程中保证蛋白质的纯度及活性非常关键。并且，由于大多数中草药基因组尚未测序，很难得到确切的蛋白序列并了解其功能，也很难利用一些基因工程技术手段大量地表达这些蛋白，影响了其应用价值。

丹参作为常用的活血化瘀药物，在治疗心血管疾病方面具有重要的作用。丹参含有多种化学成分，具有多种药理活性。目前，从丹参中分离的化学成分达100多种，有效成分主要包括脂溶性的丹参酮类和水溶性的酚酸类。多项研究表明，丹参酮类具有改善缺血、抑制心肌肥厚、抗动脉粥样硬化及抑制血小板聚集等功能。而丹酚酸类则具有活血通络的作用，常用于心脑血管疾病的治疗[11]。丹参小分子的分离鉴定及药理作用研究取得了很大的进展，但在活性蛋白研究方面仍存在不足。丹参作为第一个基因组测序的中草药，研究其活性蛋白有很大的优势。因此，笔者选择丹参作为研究对象，分离纯化及鉴定其有功能的蛋白。本研究分离并纯化得到一个相对分子质量约为25×103的蛋白，通过MTT实验及Western blot检测发现，该蛋白能够明显促进大鼠VSMCs增殖。通过质谱鉴定得到其氨基酸序列，经蛋白BLAST比对证明，该蛋白是L型的植物凝集素。根据丹参基因组序列，得到了丹参凝集素基因sml的DNA序列，利用分子克隆及蛋白表达纯化技术，得到大量高纯度的SMLP，并利用红细胞凝集实验证明体外表达纯化的SMLP具有红细胞凝集的功能。

通过本研究证明，SMLP能够促进大鼠VSMCs增殖，其可能通过激活PI3K-AKT-mTOR信号通路。VSMCs的增殖受多种生长刺激因子和抑制因子的双重调节。它们通过多种信号转导通路参与VSMCs的増殖及凋亡，其中PI3K-AKT信号通路被证明是非常重要的一条通路[12-14]。AKT蛋白在各种组织中广泛表达，如在心脏、肝脏、肾脏和骨骼肌等组织中表达，主要通过上游的PI3K磷酸化被激活，并调节下游的多个靶基因，如mTOR、核因子-κB(NF-κB)、糖原合酶激酶-3β(GSK-3β)和FKHR等，进而调节细胞的增殖、分化、调亡及迁移等[15]。本研究结果表明，SMLP能够促进VSMCs AKT和mTOR蛋白的磷酸化，并且能够抑制相关凋亡蛋白水平，从而促进其增殖。但SMLP能否促进其他细胞的增殖，以及是否还会通过其他信号通路，仍需进一步研究。

VSMCs是唯一能通过迁移、增殖和合成细胞外基质来修复受损血管壁的血管细胞，是构成血管中膜并执行相应生理功能的物质基础，具有保持血管完整性和维持血管张力的作用。SMLP能够促进其增殖，这对于VSMCs发挥正常生理功能具有重要意义。但在病理过程中，VSMCs功能障碍与疾病的发生、发展密切相关。VSMCs通过自身增殖、迁移及合成细胞外基质参与高血压、动脉粥样硬化、血管成形术后再狭窄等多种血管疾病的病理过程[16-18]。因此，阐明VSMCs增殖的调节机制，对于理解心血管疾病的发病过程及临床治疗非常关键。本研究初步发现SMLP能够促进VSMCs增殖，下一步通过体外蛋白质相互作用方法pull-down等，可以找到与SMLP相互作用的细胞表面受体，以及其激活的增殖相关的信号通路，将进一步揭示VSMCs增殖的机制，对于理解心血管疾病的发病机制有重要意义。除此之外，植物凝集素具有多种重要的功能，如凝集红细胞、参与植物的防御反应及促进淋巴细胞的分裂等，而且植物凝集素被广泛地应用于靶向性药物载体[19-20]。目前多种植物凝集素被分离鉴定，但是只能利用传统的蛋白质分离办法，其纯度及活性都很难得到保证。丹参的全基因组已经测序，这对于研究其功能蛋白就简单了很多，利用基因工程技术，可以很容易地获得高纯度并且具有活性的SMLP，这对于后续研究其功能、药物开发及应用于多个领域都非常重要。