血清25(OH)D3、miR-221水平与冠状动脉病变程度、内皮功能的关系

范迎春，李 锋，朱孟霞，朱孟允，卢静海

(1.胜利油田胜利医院检验科,山东东营 257055;2.山东省临沂市经济技术开发区人民医院检验科 276023;3.山东省临沂市第三人民医院血液科 276023;4.山东省临沂市临沭县人民医院心血管内科 276000;5.胜利油田胜利医院心内科,山东东营 257055)

冠状动脉粥样硬化性心脏病(coronary heart disease,CHD)又名冠心病，是冠状动脉发生动脉粥样硬化，造成血管腔狭窄甚至阻塞，供血不足引起心肌缺血、缺氧或坏死的慢性炎症性疾病，是当今社会危害生命健康的主要严重疾病之一[1]。冠状动脉发生病变一般预示着CHD的开始，冠状动脉病变可通过冠状动脉造影术检测手段确诊，根据冠状动脉造影结果结合Gensini积分结果即可判定冠状动脉病变程度[2]。而血管内皮功能障碍是动脉硬化向严重心血管疾病终点发展的关键因素，也是CHD的始动因素，血管内皮功能障碍可通过外周动脉张力测定(peripheral arterial tension,PAT)技术计算反应性充血指数(reactive hyperemia index,RHI)诊断血管内皮功能障碍程度[3]。25-羟维生素D3[25(OH)D3]是机体维生素D营养状况的检测指标，可直接反应机体维生素D是否缺乏，近年来有研究显示维生素D与心血管疾病的发生发展密切相关。同时越来越多的研究发现微RNA(microRNA，miRNA)与心血管疾病密切相关，而miR-221在急性心肌梗死中高表达，且与心肌肥大、心律失常、心力衰竭及心肌重塑等多种心血管疾病紧密相关，在动脉粥样硬化中能抑制血管生成[4]。因此，本研究旨在探究血清25(OH)D3、miR-221水平与冠状动脉病变程度、内皮功能的关系。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2017年1月至2018年2月胜利油田胜利医院心内科收治的CHD并行冠状动脉造影检查的患者86例作为CHD组，健康体检者30例作为对照组。纳入标准：(1)冠状动脉造影确诊的CHD患者；(2)受试者自愿参与本研究，并签署知情同意书；(3)经该院伦理委员会批准。排除标准：(1)肝肾功能不全者；(2)合并感染性疾病者；(3)合并继发性高血压者；(4)合并心瓣膜疾病者；(5)合并其他器官性心脏病者；(6)合并糖尿病、脑血管及周围血管栓塞性疾病者；(7)近期有非类固醇类抗炎药或糖皮质激素类使用史者。CHD组男49例，女37例；年龄37～82岁，平均(58.13±9.17)岁；冠状动脉单支病变23例，双支病变19例，多支病变44例。对照组男17例，女13例；年龄35～81岁，平均(56.73±8.91)岁。两组受试者性别、年龄等一般资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2样本采集 所有受试者清晨空腹抽取肘静脉血5 mL于乙二胺四乙酸二钾(EDTA-K2)抗凝管中，3 000 r/min离心5 min，分离血清于无RNA酶管中，置于-80 ℃冷冻保存备用。

1.3仪器与试剂 25(OH)D3ELISA试剂盒购自英国IDS公司，总RNA提取试剂盒、TaqMan miRNA试剂盒、SYBR Green qPCR Mix 购自美国Applied Biosystems公司，酶标仪、实时荧光定量RT-PCR仪(iCycler iQ)购自美国Bio-Rad公司，凝胶成像分析系统购自美国UVP公司，内皮功能检测仪(ZX7-Endo-pat2000)购自奥德亨医疗(中国)有限公司，全自动生化分析仪(BeckmanAU5800)购自美国Beckman Coulter有限公司，PCR引物由上海生工公司合成。

1.4检测方法

1.4.1ELISA检测25(OH)D3水平 标准品液配制；加血清样本与标准液混匀；37 ℃温箱孵育2 h；反复3次洗涤液冲洗，纸上拍干；加一抗工作液100 μL(除空白孔)，混匀；37 ℃温箱孵育1 h；洗涤液冲洗3次，吸水纸上拍干；每孔加入辣根过氧化物酶标记链霉亲和素工作液100 μL；37 ℃温箱孵育30 min；洗涤液冲洗3次，吸水纸上拍干；每孔加底物工作液100 μL混匀，避光，37 ℃温箱孵育15 min；加终止液100 μL；测定光密度(OD)值：45 nm波长测定OD值。操作步骤严格按照说明书执行。以OD值为纵坐标，标准品为横坐标绘制标准曲线，根据OD值计算出相应血清25(OH)D3水平。

1.4.2实时荧光定量PCR(quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)检测血清miR-221水平 (1)总RNA提取：将血清加入无RNA酶离心管中，加裂解液，充分混匀裂解，提取步骤按照试剂盒说明书操作，分光光度计测浓度及纯度，RNA纯度高，无降解、无DNA污染即可用于cDNA合成。(2)反转录合成cDNA：反应体系为RNA模板2.0 μL，RT引物2.0 μL，5×RT Buffer 5.0 μL，dNTP 2.0 μL，40 U/μL RNase Inhibitor 0.5 μL，20 U/μL RT酶0.5 μL，dd H2O 24.0 μL。参照反转录试剂盒步骤将RNA逆转成cDNA。(3)qRT-PCR检测：以U6做内参基因，以反转录合成cDNA为模板，反应体系：2×SYBR Green qPCR Mix 10 μL，正反向引物各1 μL，cDNA 1 μL，焦碳酸二乙酯(DEPC)水7 μL，反应总体积20 μL，每个目的基因做3个重复，反应条件：94 ℃,5 min；94 ℃ 30 min,59 ℃ 30 s，72 ℃,10 min，30个循环。启动iCycler iQ qRT-PCR仪进行PCR扩增，引物序列见表1。

表1 qRT-PCR扩增引物序列

1.4.3内皮功能检测 采用内皮功能检测仪对受试者内皮功能进行检测，受试者静卧30 min以上，左上臂佩戴充气袖，双手食指佩戴生物传感器，打开Endo-pat软件，待信号稳定，记录3次：记录5 min指端血管床血流作为基线信号，快速充气袖带(>200 mm Hg)，此时一侧指端血流信号消失，记录5 min后袖带快速放气(0 mm Hg)，指端血流信号恢复后记录5 min，结束检测。计算RHI，RHI≥1.67为正常，RHI越小，表示血管内皮功能障碍严重。

1.4.4冠状动脉造影 取桡动脉为入路，左冠状动脉取6个体位：左前斜+头位、左前斜+足位、正头位、正足位、右前斜+头位、右前斜+足位；右冠状动脉至少取3个体位：左前斜位、右前斜位、头位。病变程度评估采用Gensini评分系统对冠状动脉病变狭窄程度进行评分[6]，正常记0分，狭窄直径小于或等于25%记1分，>25%～50%记2分，>50%～75%记4分，>75%～90%记8分，>90%～99%记16分，完全闭塞记32分；参照不同冠状动脉分支确定系数，左主干病变×5；左前降支近段×2.5，中段×1.5，远段×1.0;对角支病变:第一对角支×1.0，第二对角支×0.5;左回旋支近段×2.5，钝缘支×1.0，远段×1.0，后降支×1.0，后侧支×0.5;右冠状脉近、中、远和后降支均×1。根据冠状动脉狭窄积分乘以该病变部位相应的系数，最终乘积即为Gensini积分，评分越高病变越严重。根据Gensini积分分为高分组26例(>0～<20)，中分组41例(20～<40)，低分组19例(≥40分)。

2 结 果

2.1两组血清25(OH)D3，miR-221水平及RHI比较 CHD组血清25(OH)D3、RHI明显低于对照组(P<0.05)，miR-221水平明显高于对照组(P<0.05)，见表2。

表2 两组血清25(OH)D3，miR-221水平及RHI比较

2.2不同病变程度冠状动脉血清25(OH)D3、miR-221水平、Gensini积分及RHI比较 高分组、中分组患者血清miR-221水平高于低分组(P<0.05)，且高分组高于中分组(P<0.05)；高分组、中分组患者血清25(OH)D3、RHI低于低分组，高分组低于中分组(P<0.05)，见表3。

2.3CHD患者血清25(OH)D3、miR-221水平与相关指标相关性分析 通过Pearson相关性分析显示，CHD患者血清25(OH)D3、miR-221水平与年龄、血糖、低密度脂蛋白(LDL-C)无相关性(P>0.05)；25(OH)D3与RHI呈显著正相关(P<0.05)，与Gensini积分呈显著负相关(P<0.05)；miR-221与RHI呈显著负相关(P<0.05)，与Gensini积分呈显著正相关(P<0.05)，见表4。

表3 不同Gensini积分组血清25(OH)D3、miR-221水平及RHI比较

a：P<0.05，与低分组比较；b：P<0.05，与中分组比较

表4 CHD患者血清25(OH)D3、miR-221水平与相关指标相关性分析

2.4CHD患者血清25(OH)D3与miR-221水平相关性分析 随着血清25(OH)D3水平降低，miR-221表达水平呈明显升高趋势，25(OH)D3与miR-221表达呈明显负相关(r=-0.725，P=0.000)，见图1。

图1 CHD患者血清25(OH)D3与miR-221水平相关性分析

2.5冠状动脉病变相关因素的Logistic回归分析 以冠状动脉病变为因变量，年龄、TC、TG、HDL、25(OH)D3、miR-221为自变量，进行Logistic回归分析显示，年龄、miR-221是影响冠状动脉病变形成的危险因素(P<0.05)，HDL、25(OH)D3是影响冠状动脉病变形成的保护因素(P<0.05)，TC、TG与冠状动脉病变形成无相关性(P>0.05)，见表4。

表4 冠状动脉病变相关因素的Logistic回归分析

3 讨 论

近年来，随着国民经济发展和饮食习惯的改变，CHD发病患者日趋年轻化；并且随着老龄化人口增多，CHD发病率和病死率呈逐年递增趋势，严重危害生命健康。CHD病理基础是由于冠状动脉内皮细胞受到损伤、血浆脂质出现沉积、单核细胞浸润、血管平滑肌细胞的增殖和迁移、泡沫细胞的形成及凋亡等因素引起粥样硬化斑块破裂，随血液循环在血管内形成不同程度的血栓甚至远端血管栓塞，引起冠状动脉不完全或完全堵塞所致[5-7]。引起冠状动脉病变的因素众多复杂，研究发现维生素D、miRNA与多种心血管疾病的发生发展及预后密切相关[8-9]。

维生素D是人体必需的脂溶性维生素之一，大部分来自于皮肤经中波紫外线照射在肝脏、肾脏中合成，25(OH)D3在人体内水平较高，且稳定，半衰期长，能够较准确地反应体内维生素D水平。李南阳等[10]研究发现冠心病患者血清25(OH)D3水平显著降低，其水平变化与冠状动脉病变程度密切相关。miR-221属于miRNA的一种，在多种疾病中都有异常表达，参与血细胞生成、血管生成、乳腺发育、肝癌、胰腺癌、胃癌、宫颈癌等发育及疾病发生过程，特别是恶性疾病，且可作为生物标记物。MACKENZIE等[11]研究发现，miR-221表达上调抑制血管平滑肌细胞中细胞周期调节器p27kip1，从而介导血管钙化引起动脉粥样硬化及狭窄。血管内皮功能障碍是冠心病的始动环节，导致其产生的主要原因是内皮型一氧化氮合酶表达异常，内皮型一氧化氮合酶是内皮细胞增殖、迁移及血管重塑的重要因子，同时其降低还是动脉粥样硬化和缺血性心肌病患者的特征性标志，而miR-221表达上调时可直接降低内皮型一氧化氮合酶的表达，参与动脉粥样硬化的发生发展过程[12]。RHI可直接反应血管内皮功能障碍程度，具有高敏感性，且以自身为参照，有效排除心理、环境等因素引起的血管变化影响，诊断准确性高。何珊珊等[13]研究显示RHI下降与CHD血管内皮功能障碍密切相关。本研究结果显示，CHD组血清miR-221水平明显高于对照组，25(OH)D3、RHI明显低于对照组，这与CHISTIAKOV等[14]和刘晓辉等[15]研究结果基本一致。说明CHD患者存在血清miR-221水平上调，RHI降低现象。本研究结果还显示，随着冠状动脉病变程度越高miR-221表达水平越高，25(OH)D3、RHI降低越明显，表明25(OH)D3、miR-221可能参与CHD患者冠状动脉病变的发生发展过程，并可预测冠状动脉病变程度。通过Pearson相关性分析显示，25(OH)D3与RHI呈显著正相关，与Gensini积分呈显著负相关；miR-221与RHI呈显著负相关，与Gensini积分呈显著正相关，这与JIA等[16]的研究结果基本一致。提示25(OH)D3、miR-221可能通过调节内皮功能参与CHD病程，可通过补充维生素D及降低miR-221表达水平改善血管内皮功能，延缓疾病进展及减少并发症发生。这可能是25(OH)D3缺乏时可刺激血管平滑肌细胞增殖，并促进向内膜迁移，降低血管张力的调节功能，而miR-221表达水平升高降低内皮型一氧化氮合酶的表达，内皮型一氧化氮合酶能够抑制血管平滑肌细胞增殖及内皮细胞黏附，引起细胞内皮功能紊乱所致[17-18]。Logistic回归分析显示，年龄、miR-221是影响冠状动脉病变形成的危险因素，25(OH)D3、HDL是影响冠状动脉病变形成的保护因素。提示对血清25(OH)D3、miR-221水平进行早期检测可作为冠状动脉病变及内皮功能障碍的检测指标，并通过补充维生素D与下调miR-221水平对冠状动脉病变及内皮功能障碍形成具有一定保护作用。

综上所述，经研究发现，CHD患者血清25(OH)D3表达水平降低，与冠状动脉病变程度呈负相关，miR-221表达水平上调，与冠状动脉病变程度呈正相关，维生素D缺乏越严重及miR-221表达水平越高，血管内皮功能障碍越严重，25(OH)D3、miR-221可能通过对管内皮功能的调节参与冠状动脉病变的发生发展，可作为冠状动脉病变程度的潜在生物标记物。