蒙古扁桃药材和柄扁桃药材不同部位生物碱含量测定及比较*

周红兵，郝海梅，刘 庆，高 晨，石松利,2，白迎春，王 佳，白万富

(1.内蒙古科技大学包头医学院，内蒙古 包头 014060；2.包头医学院蒙中药活性物质与功能研究所)

蒙古扁桃(Amygdalus mongolica Maxim)和柄扁桃(Prunus pedunculata)均为阿拉善荒漠种，属于蔷薇科扁桃属多年旱生落叶灌木，为蒙古高原所特有，自然分布于我国西北干旱、半干旱地区山地和沙漠之地[1]。蒙古扁桃种仁和柄扁桃种仁均是内蒙古西部地区传统中药材“郁李仁”的主要替代品，性平味苦，有止咳化痰、润肠通便之功效[2]。本课题组前期研究发现，蒙古扁桃和柄扁桃种仁中含有苦杏仁苷、不饱和脂肪酸、多糖、黄酮及微量元素等[3]。蒙古扁桃与柄扁桃所含的化学成分相似，但含量却不同。钮树芳[4]等研究发现，蒙古扁桃较柄扁桃中Ca、Mg、Cu、Zn含量高，Fe、Mn含量则显著低于柄扁桃。吴培赛[5-7]等研究发现，蒙古扁桃药材具有较强的抗氧化能力，能够显著降低高脂血症的血脂水平，对肝脏纤维化具有良好的保护作用。白迎春[8-9]等研究表明，柄扁桃种仁具有一定的降血脂作用，并且可以保护肝脏。蒙古扁桃始于大自然，富含一些如生物碱类[10]、黄酮类[11]、挥发油和有机酸[12]等较为特殊的生理活性成分。但有关蒙古扁桃药材和柄扁桃药材中生物碱含量测定与比较未见文献报道。

生物碱在中草药中广泛分布，是由各种生物(包括细菌、真菌和植物)产生的、具有生物活性的次生代谢产物[13]。生物碱类化合物具有驱虫、抗炎平喘、抑菌抗病毒等功效[14]，在抗肿瘤[15]、防治心血管疾病[16]、降糖[17]中也表现出很强生理活性。本研究测定了蒙古扁桃种仁和柄扁桃种仁中总生物碱的含量，目的是为其生物碱含量测定探求一套简单准确、便捷可靠的方法，为挖掘蒙古扁桃药材和柄扁桃药材中的活性物质、研究其化学成分及药用价值开发和资源的合理利用提供实验与科学依据。

1 材料

1.1药材来源 蒙古扁桃种仁及叶片，采于内蒙古自治区包头市九峰山，经内蒙古科技大学包头医学院药学院石松利教授鉴定为蔷薇科扁桃属植物蒙古扁桃干燥成熟种子和新鲜叶片；柄扁桃种仁及叶片，采自内蒙古自治区包头市忽鸡沟，由内蒙古科技大学包头医学院药学院石松利教授鉴定为蔷薇科扁桃属植物柄扁桃的干燥成熟种子和新鲜叶片。见表1。

表1 蒙古扁桃及柄扁桃样品来源

1.2试剂与仪器 硫酸阿托品标准品(批号：5908-99-6)，购自南京森贝伽生物科技有限公司；石油醚(分析纯)；95 %乙醇(分析纯)；氯仿(分析纯)；2 %硫酸(分析纯)；5 %碳酸钠(分析纯)；溴甲酚绿；邻苯二甲酸氢钾等。索氏提取器；回流提取装置；抽滤装置；电热恒温水浴锅(北京市永光明医疗仪器有限公司)；FA1204B电子天平(上海精科天美科学仪器有限公司)；UV-1780紫外分光光度计(日本岛津)；分液漏斗；移液管；容量瓶等。

2 方法与结果

2.1溶液的制备

2.1.1总生物碱样品溶液的制备 本研究所使用的蒙古扁桃及柄扁桃药材种仁和叶片总生物碱样品溶液制备方法流程图如下所示，见图1。

2.1.2溴甲酚绿缓冲溶液的制备 本研究所使用的溴甲酚绿缓冲溶液制备方法流程图如下所示，见图2。

图1 蒙古扁桃及柄扁桃药材种仁和叶片中总生物碱样品溶液制备流程

图2 溴甲酚绿缓冲溶液的制备流程

2.1.3对照品硫酸阿托品溶液的制备 本研究所使用的对照品硫酸阿托品溶液制备方法流程图如下所示，见图3。

图3 对照品硫酸阿托品溶液制备流程

2.2最佳测定波长的确定 将对照品硫酸阿托品溶液、种仁及叶片总生物碱样品溶液和空白溶液，分别置于1 cm比色池中，对200～800 nm波长范围内进行扫描。对照品硫酸阿托品溶液和总生物碱样品溶液分别显色后于418 nm处均有最大吸收值，因此选用418 nm作为最佳测定波长。以溶液浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

2.3标准曲线的绘制 分别精密量取对照品硫酸阿托品溶液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL置于25 mL分液漏斗中，分别加水至7 mL，加溴甲酚绿缓冲溶液4 mL，上下摇匀。随后分别加入15 mL氯仿，震荡3 min，摇匀，静置1 h。分别取下层氯仿溶液于25 mL容量瓶中，加氯仿至刻度线再次定容，震荡摇匀，于所确定的最佳波长418 nm下测定其吸光度。纵坐标为所测吸光度值，横坐标为对照品硫酸阿托品质量浓度(μg/ mL)，从而绘制标准曲线，所得回归方程为y=0.0988x+0.0826，R=0.997，总生物碱在2～12 μg/ mL的浓度范围内有良好的线性关系。见图4。

图4 对照品硫酸阿托品的标准曲线

2.4精密度实验 准确量取对照品硫酸阿托品标准溶液1 mL，于最佳波长418 nm下平行测定吸光度5次。结果显示对照品硫酸阿托品标准溶液RSD=1.18 %，表明本实验所用仪器精密度良好，符合实验含量测定的要求。见表2。

表2 精密度实验结果

2.5重复性实验 分别量取柄扁桃药材种仁与叶片总生物碱样品溶液1 mL，按照绘制标准曲线所建立的方法显色后，分别对其进行5次平行吸光度测定实验，测得柄扁桃药材种仁总生物碱样品溶液RSD=1.23 %；柄扁桃药材叶片总生物碱样品溶液RSD=1.12 %。结果表明该方法重现性良好。见表3。

表3 重复性实验结果

2.6稳定性实验 分别量取柄扁桃药材种仁与叶片总生物碱样品溶液1 mL，按照绘制标准曲线所建立的方法显色后，在室温条件下放置0、2、4、6、8、12 h，按照上述方法进行吸光度检测，计算所得柄扁桃药材种仁与叶片总生物碱样品溶液的RSD值分别为1.21 %、1.06 %。结果表明总生物碱样品溶液在12 h内稳定性良好。见表4。

表4 稳定性实验结果

2.7加样回收率实验

2.7.1柄扁桃种仁总生物碱样品溶液加样回收率测定 取6份柄扁桃种仁总生物碱样品溶液各1 mL，分别置于10 mL容量瓶中，分别加入1 mL、1 mL、2 mL、2 mL、3 mL、3 mL的对照品硫酸阿托品标准溶液，定容后充分震荡摇匀，按照绘制标准曲线所建立的方法显色后，于最佳波长418 nm下检测吸光度并计算回收率。回收率=(实验测值-样品中总生物碱含量)/对照品硫酸阿托品标准溶液加入量×100 %。计算所得平均回收率=98.83 %，RSD=1.40 %(n=6)。见表5。

表5 柄扁桃种仁总生物碱样品溶液加样回收率测试结果

2.7.2柄扁桃叶片总生物碱样品溶液加样回收率测定 取6份柄扁桃叶片总生物碱样品溶液各1 mL，分别置于10 mL的容量瓶中，分别加入1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL、6 mL的对照品硫酸阿托品标准溶液，定容后充分震荡摇匀，按照绘制标准曲线所建立的方法显色后，于418 nm下检测吸光度并计算回收率。(回收率计算同“3.4.1”)测得平均回收率=98.64 %，RSD=0.71 %(n=6)。见表6。

表6 柄扁桃叶片总生物碱样品溶液加样回收率测试结果

x=(A-b)VF/(C×m)

式中:x—样品中总生物碱的质量浓度，mg/g

A—稀释后样品的吸光度

b—标准曲线截距

C—标准曲线斜率

V—测定吸光度时样品提取液稀释体积，mL

F—样品提取液与测定时吸取样品提取液体积比值

m—样品质量，g

表7 蒙古扁桃种仁和柄扁桃种仁中总生物碱含量

注：a为与蒙古扁桃比较，P<0.05

表8 蒙古扁桃叶片和柄扁桃叶片中总生物碱含量

注：a为与蒙古扁桃比较，P<0.05

表9 蒙古扁桃及柄扁桃种仁和叶片中总生物碱含量

注：a为与种仁中总生物碱含量比较，P<0.05

3 讨论

生物碱含量测定方法有分光光度法、酸性染料比对法、酶联免疫吸附法、滴定法以及高效液相色谱法等[18]。本研究采用了酸碱提取法提取总碱，用硫酸阿托品作为对照品，酸性染料比色法测定蒙古扁桃药材及柄扁桃药材种仁及叶片中总生物碱的方法。其中，酸碱提取法操作简便、成本低廉、准确性和稳定性较好，但灵敏度稍低；酸性染料比色法灵敏度高，操作简单且重现性好，近年来已被大量应用于中药材总生物碱含量的测定中[19]。

生物碱是一类含氮有机化合物其主要存在于植物体内，多呈碱性，具有抗肿瘤、抗炎抑菌、抗病毒、抗心律失常、镇痛、解痉等生物活性[20]，同时还发现其能够防治非酒精性脂肪肝病[21]。生物碱作为一类重要的天然药物化学成分，对其进行不断深入研究更加有助于我国中草药的资源开发与利用。

本实验研究结果显示：(1)蒙古扁桃药材种仁中总生物碱含量为0.2039 mg/g，柄扁桃药材种仁中总生物碱含量为0.1472 mg/g，蒙古扁桃药材中生物碱含量显著高于柄扁桃药材中生物碱含量(P<0.05)，具有统计学意义；(2)蒙古扁桃药材叶片中总生物碱含量为0.3438 mg/g，柄扁桃药材叶片中总生物碱含量为0.3215 mg/g，蒙古扁桃药材叶片中生物碱含量明显高于柄扁桃药材叶片中生物碱含量(P<0.05)，具有统计学意义。(3)蒙古扁桃药材及柄扁桃药材叶片中总生物碱含量显著高于其种仁中总生物碱含量(P<0.05)，具有统计学意义。综合实验结果，进而确定此方法简便，准确，可靠，重复性好，可作为蒙古扁桃药材和柄扁桃药材总生物碱的含量测定方法，同时也可为扁桃属药用植物总生物碱的提取及含量测定提供指导方法。本研究结果为蒙古扁桃药材和柄扁桃药材化学成分的研究、活性物质的挖掘以及资源的持续性合理开发利用提供了实验与科学依据。