不同品种赤小豆子叶SOD提取技术优化及活性研究

张瑞益，李 强，相微微，刘 寰

（榆林学院，陕西省陕北矿区生态修复重点实验室，陕西榆林719000）

赤小豆（Vigna angrlaris），又名赤豆，豆科豇豆属，为一年生草本植物的种子，一般呈赤色，形状为椭圆形或长椭圆形，是亚洲地区主要的豆类作物之一。我国的赤小豆栽培面积、生产量和出口量均为世界第一[1]。赤小豆含有丰富的营养，其中，蛋白质含量17.5%～23.3%，淀粉48.2%～60.1%，食物纤维5.6%～18.6%[2-3]。现代药理学研究表明，赤小豆有抗氧化、降血脂、降血糖的作用[4-6]。中医认为，赤小豆性平，有解毒排脓、消肿利尿等功效[7-8]。

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）是一种可清除超氧自由基的金属酶类[9]。它是超氧化物发生歧化反应的催化剂，使超氧阴离子转化为氧气和过氧化氢，从而保护机体免受超氧阴离子自由基的危害[10-12]，起到抗辐射、抗肿瘤、延缓衰老、增强人体免疫等作用。SOD可在微生物、植物、动物体内提取到，此过程有太多的因素需要综合考虑，如：提取效率、材料资本、提取工艺可操作性、生产周期长短及最终产物活力等[13-14]，因此，并不是所有的原料都是SOD提取的理想对象。过去的SOD大多以血液为材料进行提取，此过程不仅工艺复杂、不易保存、制备成本高，而且还会引发病毒交叉感染的潜在危险[15]。相比之下，以植物为材料提取SOD有较高的安全性，为了高效提取SOD，近些年来国内外很多学者进行了大量研究。超声波辅助提取法通过破坏细胞组织来提取物质，使得浸提效果强化，与其他方法相比，具有提取效率高、耗能低、提取时间短等优点[16-18]。

本试验以京农红8号赤小豆为材料，采用单因素试验和正交试验优化出赤小豆子叶SOD提取的最佳工艺条件，并应用最佳工艺条件对8个不同品种的赤小豆子叶SOD进行提取和分析，旨在研究赤小豆不同组织SOD的含量，同时也为赤小豆资源在农业、医药、食品等方面更好、更充分的利用提供了理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

供试赤小豆品种为京农8号、吉红2号、冀红9218、辽小豆2号、中红10号、小丰2号、白红3号、龙小豆3号，均由榆林市农业科学院提供。其中，京农8号为本试验SOD提取技术优化的对象。

核黄素（VB2）购于上海试剂二厂；浓盐酸、氢氧化钠、L-甲硫氨酸（Met），均购于天津市致远化学试剂有限公司；乙二胺四乙酸（EDTA），购于西安化学试剂厂；氯化硝基四氮唑蓝（NBT），购于上海蓝季科技发展有限公司；乙二胺四乙酸二钠，购于天津市科密欧化学试剂有限公司。

1.2 方法

1.2.1 赤小豆的培养 称取200 g颗粒饱满、大小均匀的京农8号赤小豆种子，浸泡于蒸馏水中10 min，之后将其在培养皿中铺匀，置于28℃恒温箱中进行观察（此过程培养皿需保持一定水分，并及时清除霉变个体）。待芽体长至15 cm左右，取子叶研磨，以备用。其余7种赤小豆培养方法相同。

1.2.2 赤小豆SOD提取流程 在赤小豆子叶研磨物中加0.05 mol/L磷酸缓冲液混匀，置于超声波提取器，之后在水浴锅中浸提，最后在4℃，1 000 r/min的条件下离心10 min，取上清液定容至50 mL备用。

1.2.3 单因素试验 在7个影响赤小豆子叶SOD活性的相关因素中，变化其中一种参数，固定其他参数，测定赤小豆子叶SOD的活力大小，得出一定的规律，来确定7个相关因素的最优值。具体参数设置列于表1。

表1 单因素参数设计

1.2.4 正交优化试验 根据单因素试验的结果，可知磷酸缓冲液pH值、液固比、超声波功率、水浴浸提温度这4个因素对赤小豆SOD提取结果影响较大。设计表2所示的4因素3水平试验，得到最优的赤小豆子叶SOD的提取方法。

表2 正交试验（L9（34）因素水平

1.2.5 赤小豆子叶SOD提取率计算 首先进行光照反应，将装有SOD提取液的试管置于荧光灯下20 min；其次测定吸光值，光度计为560 nm；最后根据所得吸光值计算SOD的活力，计算公式如下。

式中，W为样品鲜质量（0.5 g）；v为测定酶液用量（0.1 mL）；V 为提取液总量（20 mL）；u为 1个酶活单位。

1.2.6 不同品种赤小豆子叶SOD含量测定 用正交试验优化出的各因素最佳值，提取8个品种的赤小豆子叶的SOD，并测出其活性。

1.3 数据分析

所有测定数据采用Microsoft Excel 2010和SPSS19.0进行分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 超声功率对赤小豆子叶SOD提取率的影响

由图1可知，超声功率为140 W时，赤小豆子叶SOD活力值最大，为13.61 U/g；当超声功率为125，155 W时，二者间SOD活力没有显著差异，分别为 10.91，11.27 U/g；当超声功率为 110，170 W时，二者间SOD活力也没有显著差异，170 W时，SOD活力值最低，为6.47 U/g。可知，在超声功率为140 W时，SOD的活力值最大，为赤小豆子叶SOD提取的最适宜超声功率条件。

2.1.2 液固比对赤小豆子叶SOD提取率的影响

由图2可知，在不同液固比条件下，SOD活力差异显著。SOD活力随着固液比的增大呈现先增大后降低的趋势。在液固比为20∶1（mL/g）时，SOD的活力达到最大值，为赤小豆子叶SOD提取的最适宜液固比。

2.1.3 磷酸缓冲液pH值对赤小豆子叶SOD提取率的影响 由图3可知，不同pH值条件下，SOD的活力存在显著差异。随磷酸缓冲液pH值的增大，SOD活力呈现先增大后降低的趋势。在pH值为7.0时，SOD的活力达到最大值，为赤小豆子叶SOD提取的最适宜pH条件。这是由于SOD的酶特性，其活性很容易受到pH值大小的影响。

2.1.4 水浴浸提温度对赤小豆子叶SOD提取率的影响 由图4可知，当水浴浸提温度为50℃时，赤小豆子叶SOD活力最大，为12.82 U/g；当水浴温度为40，60℃时，二者间SOD活力没有显著差异，SOD活力分别为11.21，10.64U/g；当水浴温度为30，70℃时，二者间SOD活力也没有显著差异，70℃条件下，SOD活力最低，为6.54 U/g。可知，在水浴温度为50℃时，SOD的活力达到最大值，为赤小豆子叶SOD提取的最适宜水浴温度条件。当温度高于50℃时，可能会对SOD造成部分损害，而温度过低时，SOD提取不够充分。

2.1.5 超声时间对SOD提取率的影响 由图5可知，不同的超声时间条件下，SOD活力存在显著差异。随着超声时间的增加，SOD活力呈现先增大后降低的趋势，在超声时间为25 min时，SOD活力达到最大，该时间长度为赤小豆子叶SOD提取的最适宜超声时间。超声时间在一定范围内增大可以使SOD的提取更加充分，但是超声时间过长反而会影响SOD的活力。

2.1.6 水浴浸提时间对SOD提取率的影响 由图6可知，不同的水浴浸提时间下SOD活力有显著差异，当水浴浸提时间为1.5 h时，SOD活力达到了最大值。水浴浸提时间太长会影响SOD的活性，时间太短会使SOD提取不够充分。

2.1.7 超声水浴温度对SOD提取率的影响 由图7可知，超声水浴温度在30～50℃时，SOD的活力随温度的增加呈现先增大后降低的趋势。在温度为45℃时，SOD活力达到最大值，该值为赤小豆子叶SOD提取的最适宜温度。当温度大于45℃时，SOD活力反而下降，可能是由于高温对SOD酶性产生了影响，其中，SOD活力在超声水浴温度在30，50℃之间差异不显著。

2.2 正交试验

表3 正交试验结果分析

由单因素的试验结果可知，影响赤小豆子叶SOD提取率的4个主要因素为液固比、超声功率、磷酸缓冲液pH值和水浴浸提温度。在采用单因素试验所得的最佳超声水浴温度、最佳超声时间及最佳水浴浸提时间的条件下，正交试验分析4因素3水平下赤小豆子叶SOD提取的最适宜工艺参数，具体结果列于表3。

由表3可知，最优组合为A2B2C2D1，即液固比为15∶1（mL/g）、超声提取功率为140 W、磷酸缓冲液pH值为7.0和水浴浸提温度40℃，是赤小豆子叶SOD提取的最佳工艺参数。以上各因素对试验指标影响都较大，但超声功率对赤小豆子叶SOD活力影响最大，4种因素的主次顺序为B＞C＞A＞D。

2.3 不同品种赤小豆子叶SOD的含量分析

对8种赤小豆子叶SOD用优化的最佳条件进行测定，结果列于表4。从表4可以看出，8种品种的SOD值均存在显著差异；其中，SOD活性最高的为小丰7号，其活性为14.17 U/g，活性最低的是吉红2号，其活性仅为8.97 U/g，8种品种赤小豆子叶SOD活性在8.97～14.17 U/g之间变动，其SOD活性极差为5.20 U/g。

表4 不同品种赤小豆子叶SOD活力值 U/g

3 讨论

本试验首先以京农红8号赤小豆子叶为SOD的提取材料进行单因素试验，根据所得结果设计正交试验，来优化影响赤小豆子叶SOD提取率的4种主要因素，最终得出最优且可行的组合为超声提取功率140 W、磷酸缓冲液pH值7.0、液固比15∶1（mL/g）、水浴浸提温度40℃。4种因素影响从大到小的顺序为超声功率＞磷酸缓冲液pH值＞液固比＞水浴温度，超声提取功率这一因素影响最大。

利用优化试验得出的SOD最佳提取工艺对8种赤小豆子叶SOD进行提取，并比较它们SOD的活力值，结果表明，8种赤小豆子叶SOD的活性有显著差异，其值在8.97～14.17U/g，其中，小丰7号赤小豆子叶SOD活力最高，为14.17 U/g，而吉红2号赤小豆子叶SOD活力最低，其活力值仅为8.97 U/g。造成这种差异的原因可能是由于培育不同品种赤小豆的土壤、气候、人为灌溉、施肥等因素的不同所致，也可能是由于不同品种赤小豆自身生活的理化性质导致。本试验结果在一定程度上可以为今后更好的在农业、医药、食品等方面利用赤小豆资源提供一定的理论依据。