枯草芽孢杆菌与钾联用对黑腐皮菌的抑制作用

翟世玉 ，殷 辉 ，周建波 ，唐秀丽 ，吕 红 ，韩巨才 ，赵晓军

（1.山西农业大学农学院，山西太谷030801；2.山西省农业科学院植物保护研究所，山西太原030031；3.农业有害生物综合治理山西省重点实验室，山西太原030031）

苹果树腐烂病在我国苹果产区发生普遍[1]，是由黑腐皮壳属病菌（Valsa spp.）引起的一种毁灭性真菌病害[2-4]。生产中通过提高苹果树体内的钾含量[5-6]、保持适宜的土壤水分条件[7]及利用生防菌剂[8]等来防治苹果树腐烂病。孙广宇等[5]研究表明，苹果树叶片钾含量与腐烂病的发病程度呈极显著的负相关关系，即腐烂病发生越严重的果树，叶片内含钾量越低。季兰等[9]研究表明，生产中施钾较少是我国苹果树腐烂病发生严重的原因之一。王金友[10]研究提出，适当增加苹果树皮中的钾含量，能提高苹果树体的抗病能力，有效减轻病害的发生。然而，生产中只通过施用钾肥防治腐烂病有其局限性，通常辅以其他措施来防治。

生物防治措施具有环境兼容性好、不易产生抗药性等优点，符合现代社会对农业生产的要求且越来越受到人们的关注[11]。枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）作为黑腐皮菌（Valsa mali）的生防菌目前已成为国内外研究的热点，其对黑腐皮菌具有较好的抑制作用[12-14]。但是枯草芽孢杆菌在抑制黑腐皮菌的过程中会出现退化现象，随着时间推移抑菌率降低[15]。

为提高生防菌的稳定性，国内外研究者将生防菌与化学药剂[16-17]联用后发现有协同增效的作用。如马志强等[18]将哈茨木霉菌与啶酰菌胺联用后对番茄灰霉病菌表现出协同增效作用。毕秋艳等[19]研究表明，枯草芽孢杆菌与氟环唑联用对禾谷镰孢霉表现出持效和增效作用。姚克兵等[20]提出将枯草芽孢杆菌制剂BCA与吡唑醚菌酯（PS）联用，发现可以提高生防菌的存活率，同时增加对病害的防治效果。谷春艳等[21]将解淀粉芽孢杆菌与咪鲜胺联用，发现其对草莓炭疽病的防治效果极显著高于施用2个单剂。除生防菌剂和化学药剂联用表现协同作用外[22-23]，胡清玉等[24]以枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）为主要菌群和肥料联用，通过根施该菌肥能显著降低腐烂病的发生。

菌肥联用在生产上有一定防效[25-26]，但生防菌和肥联用后对生防菌的影响及其抑菌率等的研究尚无相关报道。本研究拟将对黑腐皮病菌有较好抑制作用的枯草芽孢杆菌和钾联用，探索枯草芽孢杆菌和钾联用后对黑腐皮菌的抑菌效果，以期提高枯草芽孢杆菌的抑菌率和保持其抑菌的稳定性，为使用菌肥防治苹果树腐烂病提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

供试菌株：病原菌为苹果黑腐皮菌（Valsa mali），YC90；生防菌为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），LF17。菌株于山西省农业科学院植物保护研究所植物病害研究室保存[27]。

试剂：99.5%磷酸二氢钾（KH2PO4）原药（天津市博迪化工有限公司）；99.5%氯化钾（KCl）原药（天津市天大化工实验厂）；99.0%硫酸钾（K2SO4）原药（天津市凯通化学试剂有限公司）。

供试培养基：PDA培养基[28]；NB培养基[29]。

仪器：WFZUV-2800H型紫外可见分光光度计（尤尼柯上海仪器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 发酵液母液的制备 将枯草芽孢杆菌菌株LF17在PDA上活化后，用打孔器取2个菌饼，接种至100 mL NB液体培养基中，28℃，180 r/min摇培72 h后得到枯草芽孢杆菌种子液。将种子液按1%（5.6×109cfu/mL）的接种量接入100 mL NB培养基中，于28℃，180 r/min摇培72 h制成发酵液母液于4℃保存备用[30-31]。

1.2.2 枯草芽孢杆菌菌体生长量的测定 配制系列质量浓度为 300，150，100，20，1 mg/mL 的 KH2PO4及KCl母液，系列质量浓度为100，20，1 mg/mL的K2SO4母液，4℃保存备用。将上述母液与NB培养基按体积比1∶10充分混匀后制成含钾的NB培养基，灭菌待用。每毫升含钾的NB培养基接种0.01mL发酵液母液，28℃，180 r/min的条件下培养72 h，测定发酵液OD600值，每个处理重复3次，以含钾质量浓度0 mg/mL的发酵液为对照。以未接菌含不同浓度钾的NB培养基为背景，采用比浊法[32]测定OD600值，并计算枯草芽孢杆菌活菌数，计算公式[27]如下。

1.2.3 枯草芽胞杆菌和钾的协同作用测定 参考毕秋艳等[19]采用的固体平板扩散法-打孔法测定抑菌活性，测定不同浓度含钾发酵液对黑腐皮菌的影响。在PDA平板中心画2条十字交叉线，每条线等分3份，等分点处用打孔器打4个直径为5 mm的孔，分别注入30 μL含不同浓度KH2PO4，KCl的枯草芽孢杆菌发酵液后，在平板中心接种5 mm黑腐皮菌菌饼，将培养皿正面朝上，于28℃恒温放置3 h后倒置培养，发酵液和含不同浓度KH2PO4，KCl的含钾发酵液为处理，以只接黑腐皮菌为对照，3次重复。分别于3，5，10 d后测定黑腐皮菌落直径，计算菌丝生长抑制率，公式如下。

1.3 数据处理

采用Excel 2003，SPSS 17.0软件对试验数据进行分析处理，其中，用SPSS 17.0进行数据方差分析；用Excel 2003和HemI对数据进行整理绘图。

2 结果与分析

2.1 不同质量浓度 KH2PO4，KCl，K2SO4对枯草芽孢杆菌活菌数的影响

枯草芽孢杆菌发酵液中加入不同质量浓度KH2PO4，随着质量浓度增加活菌数呈上升趋势，与活菌数为5.6×109cfu/mL的对照相比，增幅范围为 2.2×108～1.5×109cfu/mL，KH2PO4质量浓度为10 mg/mL时，活菌数最多，达7.1×109cfu/mL；发酵液中加入不同质量浓度KCl，活菌数呈缓慢上升趋势，增幅范围为 9.0×107～1.4×108cfu/mL，KCl质量浓度为30 mg/mL时，活菌数最多，达5.74×109cfu/mL；发酵液中加入不同质量浓度K2SO4，质量浓度为2 mg/mL时相比对照活菌数增加了2.7×108cfu/mL，其他质量浓度相比对照活菌数呈降低趋势，K2SO4质量浓度为10 mg/mL时，活菌数量最少，比对照降低了 1.72×109cfu/mL（图 1）。

2.2 枯草芽孢杆菌发酵液与KH2PO4联用对黑腐皮菌的抑菌效果

发酵液中KH2PO4质量浓度增加，对黑腐皮菌的抑菌率升高。各个处理的抑菌率有差异，其中，10，15 mg/mLKH2PO4发酵液抑菌效果最佳。随着时间的推移，各个处理的抑菌率明显提高，10 d时达到最佳抑菌效果且趋于稳定（图2）。

结果显示，培养3d，当KH2PO4质量浓度为15mg/mL时，抑菌率最高，达80.22%，高于对照（58.27%），增幅为5.47～19.78百分点，与对照相比差异显著（P＜0.05）；培养5 d时，KH2PO4质量浓度为10 mg/mL的抑菌率最高，达到91.11%，高于对照（88.16%），但差异不显著；培养10 d时抑菌率值达到最高，其中，KH2PO4质量浓度为15 mg/mL时抑菌率最高，达到96.33%，各处理与对照相比增幅为2.22～4.11百分点，差异显著（P＜0.05）。抑菌率总趋势随时间的推移而提高（图3）。

2.3 枯草芽孢杆菌与KCl联用对黑腐皮菌的抑菌效果

随着发酵液中KCl质量浓度升高，含钾发酵液的抑菌值随KCl质量浓度增加逐渐增大，后又呈下降趋势，其中，2 mg/mL质量浓度的抑菌效果最佳。随时间的推移，对黑腐皮菌的抑菌率趋于稳定，当KCl质量浓度为2 mg/mL，培养10 d时的抑菌效果最好（图 4）。

结果显示，培养3 d时KCl质量浓度为2 mg/mL的发酵液抑菌率最高，达92.48%，比对照增加7.77百分点，与各处理相比差异显著（P＜0.05）；培养5 d，KCl质量浓度为2 mg/mL的发酵液抑菌率最高，达93.33%，高于对照（89.72%），与各处理相比差异显著（P＜0.05），且其余各质量浓度抑菌率均低于对照；10d时的抑菌率最高，当KCl质量浓度为2mg/mL时抑菌率最高，达到95.56%，高于对照（90.96%），与各处理相比差异显著（P＜0.05）。随时间的推移，对黑腐皮菌的抑菌率提高，发酵液中KCl质量浓度为2 mg/mL时的抑菌率最好（图5）。

3 结论与讨论

枯草芽孢杆菌主要通过拮抗物质、诱导植物抗性、竞争作用和溶菌作用等机制同时或分别作用达到对病原菌的抑制作用[33-34]。如何使枯草芽孢杆菌抑菌率提高、抑菌效果稳定是研究的重点[35]。KH2PO4和KCl与枯草芽孢杆菌联用直接或间接影响枯草芽孢杆菌的生防功能[36]。本研究在枯草芽孢杆菌发酵液中加入不同钾肥，发现含KH2PO4的发酵液中活菌数明显增加，当质量浓度为10 mg/mL时，活菌数最多。相比对照，含KH2PO4的发酵液对黑腐皮菌的抑菌效果表现为稳定、抑菌率提高。其中，培养10 d时，含不同KH2PO4质量浓度的发酵液的抑菌率达到最高且趋于稳定，各处理差异不显著。因此，混用二者时KH2PO4的质量浓度为0.1 mg/mL即可起到增效作用。在发酵液中加入KCl后对枯草芽孢杆菌生长影响较小。当发酵液中KCl的质量浓度为2 mg/mL时抑菌效果最佳。

本研究中含KH2PO4的发酵液中的活菌数明显增加，提高了枯草芽孢杆菌离体竞争的能力，进而表现为增效作用。KCl没有显著提高发酵液中的活菌数，但是提高了发酵液抑菌的稳定性，可能其对枯草芽孢杆菌拮抗物质有影响，其增效机制还需深入研究。此外，由于K2SO4在发酵液中的溶解性较低，试验仅设置了3个质量浓度梯度，有一定局限性；结果表明，发酵液中加入K2SO4活菌数呈显著减少趋势，尚无法明确K2SO4和枯草芽孢杆菌之间的相互关系，还需进一步研究。

通过研究枯草芽孢杆菌和钾联合作用机制，可以使二者达到优势互补，发挥多位点、多途径的特点，从而达到增强抑菌和防病效果[37-38]。胡清玉等[24]研究发现，以枯草芽孢杆菌为主要菌群和钾肥联用可增强苹果树的树势，显著降低腐烂病病疤复发率；推测协同增效机制是钾肥能够提高枯草芽孢杆菌的竞争力和树体组织抗腐烂病菌扩展能力，从而增强了防治效果。然而，不同类型的钾肥与枯草芽孢杆菌联用后对黑腐皮菌的抑菌效果直接影响着枯草芽孢杆菌的生防潜力[39]。本研究结果表明，KH2PO4和枯草芽孢杆菌的协同增效作用、兼容性最好，KCl提高了发酵液抑菌的稳定性。本试验测定钾和枯草芽孢杆菌联用对黑腐皮菌的抑菌效果，针对钾和枯草芽孢杆菌联用后拮抗物质、植物抗病性及寄主体内物质竞争能力等问题，现阶段还没有相关的研究报道，结论尚无法明确，还需下一步进行深入研究。