牛结核病疫苗研究进展

张喜悦

（中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032）

1 医用结核病疫苗研究现状

全球范围内，结核病是导致人类死亡的十大原因之一，每年有数百万人患上结核病。据世界卫生组织（WHO）估计，2017年全球约有1 000万人新感染结核，我国估计有88.9万人新感染结核[1]。然而，在过去的100年里，唯一实际应用的疫苗仍然是卡介苗（Bacille calmette guerin，BCG）。近年来，随着基因技术的进步，学者们尝试从多种途径研发新型疫苗。常用的研发途径有3种：一是对卡介苗进行改进，包括重组卡介苗，或者对野毒株进行改进，开发出新的疫苗；二是使用病毒载体或结核免疫原性蛋白质，加上必要的佐剂；三是开发治疗性疫苗，以减少结核病治疗的持续时间。目前，进入临床试验的新型疫苗共有15种[1]，另外还有2种临床试验终止疫苗（表1）。

2 牛结核病疫苗研究现状

2.1 野生动物疫苗

世界很多发达国家均较好地实施了牛结核病根除计划。这些根除计划是基于检疫扑杀策略实施的。但该策略存在着很多问题，如野生动物宿主的存在严重影响牛结核病防控。英国和爱尔兰的獾、新西兰的刷尾负鼠、西班牙的野猪等均为牛结核病易感动物宿主，且这些宿主持续向家畜传播牛结核病，使得这些地区牛结核病的根除变得极为困难。因此，必须考虑对这些野生动物应用疫苗，以控制牛结核病。

用BCG免疫野生动物，会导致野生动物向家畜传播BCG并存在干扰结核菌素试验（PPD）的可能性，但这种情况尚未被证实。BCG可在某些种类的野生动物（白尾鹿）体内，存活达9个月，并可传播至其同群动物。因此，在野生动物免疫BCG的情况下，应该考虑在该地区的牛中，也使用疫苗进行免疫，以防止疫苗株由野生动物向牛传播。目前，新西兰、英国和西班牙等地均已开展了野生动物免疫试验[5-6]。

新西兰刷尾负鼠：1995—2002年，攻毒试验证实口服、注射和黏膜（如喷气装置）免疫有显著效果；2009年，田间试验证实BCG免疫有69%～95%的效果。口服试验中，将BCG包裹于脂质体中，可防止胃液失活疫苗活性。同时在诱饵上使用防水措施，并将诱饵挂于刷尾负鼠栖息地的树上，这样可有效提高免疫率。

英国獾：1998年至今，攻毒试验证实口服、注射和黏膜（如喷气装置）免疫有显著效果。2011年，田间试验证实BCG免疫可使血清学阳性率降低73.8%[5]。

表1 临床和临床终止阶段的结核病新型疫苗研究状况[2-4]

西班牙野猪：2009年至今，试验证实BCG可提供有效保护。2011年至今，证实灭活的牛分枝杆菌可提供类似于BCG的保护作用。

2.2 牛疫苗

由于牛结核病疫苗会对PPD形成干扰，造成假阳性，现在全球都禁止使用疫苗免疫牛。WHO也不赞同使用疫苗免疫牛，但很多学者仍然进行了大量的牛结核病疫苗研究。

在过去的20年中，牛结核病疫苗研究取得了一些重要进展，主要集中在减毒分枝杆菌菌株、DNA疫苗、亚单位疫苗（如培养滤液蛋白、MPB70）研发和免疫策略研究上。对于DNA和亚单位疫苗中不同免疫调节剂（如脂肽、CpG、菌落刺激因子等）的应用，也进行了广泛研究。某些DNA、亚单位疫苗可明显增强BCG的免疫效果，但单独使用时其效果均弱于BCG。因此，当前可以进行田间应用的免疫策略是单独使用BCG，或者使用BCG初免、新型疫苗加强免疫的免疫策略。试验已经证实，腺病毒载体Ag85A疫苗，在攻毒试验中可以保护大部分牛免于形成结核病变[7-9]。

由于检疫扑杀策略未能防止牛结核病流行，英国开展了大量的牛结核病疫苗研发工作，如开展了免疫保护试验[8]，以验证疫苗对牛的保护力。从2005年开始，APHA即开始进行试验。试验对象为80头免疫牛、64头对照牛。攻毒试验中，80头免疫牛中的29头牛没有病变，而64头对照牛中，仅有2头牛没有病变。免疫牛中的无病变牛，细菌培养也呈阴性，表明BCG甚至在重度攻毒试验中，仍能提供有效保护。免疫后25 d可建立免疫反应，基于可见病变减少的程度，表明疫苗的保护率为76%（50%～100%）。同其他动物一样，BCG对牛可以提供不同程度的保护，对部分牛只不产生保护。当BCG接种于新生牛和犊牛时，其产生的保护作用要高于接种于成年牛；BCG Pasteur株和BCG Danish 株可以诱导相等的保护力，黏膜免疫也会产生保护力。BCG免疫会干扰PPD，且这种干扰至少会持续6个月。BCG的保护力与PPD阳性情况并不相关，如皮肤试验阴性的BCG免疫动物，仍然会像皮肤试验阳性的BCG免疫动物一样被保护。同时，还有试验认为，BCG免疫后，其保护力可维持12个月，免疫24个月后保护力明显下降。

增强BCG免疫效果的方法有两个：一是初免时扩大或加强免疫，二是在免疫效应降低时加强免疫。新西兰研究者认为，小牛在6周后用BCG加强免疫，反而会影响初免时BCG的保护力。目前最成功的免疫策略是利用Ag85A病毒载体疫苗加强免疫。APHA在过去6年的试验中发现，BCG-病毒载体疫苗的免疫策略始终表现出强化BCG效果的效应，如比BCG免疫更少的可见病变动物和病理变化，且这种效应与人医疫苗的研究成果一致。因此，针对牛结核病，最有效的免疫策略是BCG初免，新型疫苗加强免疫。

但牛结核病疫苗的应用，面临着科学和法律法规的挑战：一是必须要有适当的鉴别诊断试剂，因为BCG会干扰正常的PPD；二是欧盟国家禁止免疫牛，必须要改变这些法律法规；三是疫苗需要更多的安全性试验，以说服决策者接受使用疫苗的建议。为此，欧盟开展了结核病阶梯项目（TBSTEP）[10]。该项目的主要目标是研究根除牛结核病的适当策略。项目组由多领域的成员组成，包括研发疫苗和诊断试剂的小组，其目标为：（1）测试新型重组腺病毒疫苗（表达TB多重抗原），用于BCG初免以及病毒载体疫苗加强免疫的牛免疫策略；（2）研发DIVA（鉴别诊断）试剂，以鉴别疫苗和野毒感染。此外，欧盟食品安全局于2013年向欧盟委员会提出建议，要求开展牛结核病疫苗的田间试验[11]。同时，鉴于BCG Danish 1331是欧盟唯一的官方许可疫苗菌株，APHA向英国兽医卫生主管机构提供了一系列资料，包括该疫苗的安全性和应用数据，以获得该疫苗作为牛结核病疫苗的兽用许可，同时申请开展田间试验。