贵州草海小龙虾虾青素提取条件及含量测定

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(1.贵州师范大学生命科学学院，贵州 贵阳 550000；2.贵州省林业厅，贵州 贵阳 550000；3.贵州师范大学喀斯特洞穴研究中心，贵州 贵阳 550000)

虾青素(Astaxanthin)是一种非维生素A源类的胡萝卜素，在常温中呈现紫黑色结晶的粉末状态，易被氧化且对阳光异常敏感，易溶于丙酮、二氯甲烷和氯仿等多数有机溶剂中[1]。虾青素具有抗氧化的性质，其分子式中具有活泼的电子效应，极易和自由基发生反应而使自由基被清除，水产类生物体中含有虾青素可以起到免疫、着色和保险的作用，对鱼类的生长调节具有重要的作用，因而被誉为“超级维生素E”和“超级抗氧化剂”[2-5]。

自上世纪80年代开始，许多专家和学者对虾青素的生物学功能进行大量研究，发现虾青素拥有很多重要的生物学功能，安全性较好，因而越来越被人们所关注[6-7]。当前虾青素的主要来源有：从雨生红球藻中提取[9-10]、用法夫酵母生产[11-12]、从甲壳类水产废弃物中提取[13-14]。陈西广、何立坚[6、8]等研究了用乙酸乙酯浸提法提取甲壳类虾青素的工艺流程，张芬[15]等用高效液相色谱法测定了小丑鱼体内虾青素的含量，宋庆洋[16]等研究了克氏原螯虾虾壳在三种不同干燥条件下虾青素提取的效果，杜云建[17]等采用稀碱法从虾壳中提取虾青素，孙来娣[18]等研究了二氯甲烷一甲醇溶液提取南极磷虾粉虾青素的工艺条件。为了探究贵州草海小龙虾(Procambarusclarkii)不同部位虾青素含量，本研究中以贵州草海的小龙虾为原料，采用单因素实验确定最佳提取条件，运用分光光度法测定草海小龙虾不同部位虾青素的含量。

1 材料与方法

1.1 实验材料

小龙虾(草海自然水域捕获)、FA-1004型电子称、HWS28型电热恒温水浴锅、752型紫外可见分光光度计、SHZ-D(Ⅲ)型循环水真空泵、旋转蒸发器RE-2000、乙酸乙酯(分析纯AR)、乙醇(分析纯AR)、石油醚(分析纯AR)、异丙醇(分析纯AR)、二氯甲烷(分析纯AR)、烧杯、试管、漏斗、虾青素标样。

1.2 方法

1.2.1 样品处理 虾壳处理：将小龙虾虾壳剥离去肉清洗干后，放入55 ℃的烘箱中烘干，称量；将干虾壳放入打粉机中打粉。

去蛋白质处理：取适量打好的干虾粉，加入胃蛋白酶在温度60 ℃、pH值为2.5的条件下水解1 h，水解后将滤渣进行抽滤，用蒸馏水水洗至中性，在阴凉通风处自然干燥。

虾青素提取：称量已定量经过去蛋白处理的虾壳粉，将样品转入烧杯中，加入适量的溶液，搅拌均匀，在一定温度下浸提一段时间后，滤去溶液中的废渣，得虾青素提取溶液。

1.2.2 内脏、虾肉中虾青素的提取 内脏、虾肉中虾青素的提取方法同1.2.1相同。

1.3 绘制虾青素标准曲线

配置标准溶液：用电子天平称取1 mg的虾青素标准样品放入50 mL的容量瓶中，加入25 mL的乙酸乙酯溶液，配置得到0.04 mg·mL-1的虾青素标准溶液。使用时用10 mL乙酸乙酯溶液分别稀释成5、4、3、2和1 μg·mL-1等不同浓度梯度的虾青素标准溶液。将稀释后的溶液置于紫外分光光度计中(吸收波长为474 nm)测定吸光值。以稀释浓度为横坐标，虾青素的吸光值为纵坐标，制作虾青素的标准曲线图。

1.4 虾青素提取的单因素实验

1.4.1 提取溶剂的选取 用天平称取5份经过去蛋白处理的虾壳粉放入25 mL的试管中，分别将10 mL的乙醇、石油醚、乙酸乙酯、异丙醇和二氯甲烷加入到5个试管中，在常温下提取3 h后，将溶液进行旋蒸干燥，分别再加入10 mL的石油醚溶液，将溶液置于紫外分光光度计中(吸收波长468 nm)测定吸光值。

1.4.2 料液比的选择 用天平称取5份经过去蛋白处理的虾壳粉放入25 mL的试管中，然后加入1.5 、3、4.5、6和7.5 mL的乙酸乙酯溶液，常温下浸提3 h，旋蒸干燥后，将溶液置于紫外分光光度计中(吸收波长474 nm)测定吸光值。

1.4.3 提取温度的选取 用天平称取8份经过去蛋白处理的虾壳粉放入25 mL的试管中，分别加入10 mL乙酸乙酯溶液，将试管放入20、30、40、50、60、70、80和90 ℃的水浴锅中进行加热1 h后，将溶液置于紫外分光光度计中(吸收波长474 nm)测定吸光值。

1.4.4 提取时间的选取 用天平称取5份经过去蛋白处理的虾壳粉放入25 mL的试管中，加入10 mL乙酸乙酯溶液，在温度为60 ℃的水浴锅中分别加热1 h、2 h、3 h、4 h、5 h后，将溶液置于紫外分光光度计中(吸收波长474 nm)测定吸光值。

1.4.5 提取次数的选择 用天平称取3份经过去蛋白处理的虾壳粉放入25 mL的试管中，加入10 mL乙酸乙酯溶液，在60 ℃的水温下提取1 h后，将溶液进行过滤，滤渣重新加入10 mL乙酸乙酯溶液重新加热。此步骤重复4次，将4次所得溶液置于紫外分光光度计中(吸收波长474 nm)测定吸光值。

1.4.6 小龙虾不同部位虾青素含量的测定 用天平分别称取处理后的虾壳样品2.0 g、内脏样品5.0 g和虾肉样品25 g，按照单因素实验中所得的最佳提取条件对小龙虾3个部位的样品进行虾青素提取，并通过标准曲线计算不同部位虾青素的含量。

2 结果与讨论

2.1 虾青素标准曲线图

在乙酸乙酯最大的吸收波长474 nm处测得虾青素各梯度标准溶液的吸光值(如图1所示)，乙酸乙酯溶液中虾青素浓度和吸光值之间的关系式为y=0.166 4 x+0.018 4，R2=0.999 4，线性关系良好。

图1 虾青素标准曲线图

2.2 单因素提取实验的结果

2.2.1 溶剂的提取效果 从图2中可以看出，5种不同溶剂对于虾青素的提取效果差异明显，其中乙酸乙酯溶液的提取效果最佳，所以选择乙酸乙酯溶液为最宜提取溶剂。

2.2.2 料液比的最佳提取结果 从图3种可以看出，随着乙酸乙酯溶液用量的增加，料液比由1∶1到1∶2时吸光度增加幅度较大，而料液比为1∶2之后随着溶液的增加吸光值变化不明显，所以最佳的料液比为1∶2。

图2 不同溶剂的提取效果图

图3 不同料液比下的吸光值图

2.2.3 提取温度的最佳结果 从图4中可以看出，随着提取温度的增加吸光值也呈现出增大的趋势，当温度在60 ℃时吸光值达到最大，60 ℃后吸光值呈现减小的趋势，故最佳的提取温度应为60 ℃。

2.2.4 提取时间的结果 由图5可以看出，随着提取时间的增加，吸光度值在2 h处达到最高，此后随着时间增加吸光度值呈现下降趋势。故选择最佳的提取时间为2 h。

图4 不同提取温度下的吸光值变化图

图5 提取时间对提取效果的影响

2.2.5 提取次数的结果 3份虾壳样品经过4次提取后，提取结果如表1所示。经过前两次乙酸乙酯溶液浸提后，多数虾青素已被提取出来，以至于3、4次提取出的虾青素很少，所以最佳提取次数为2次。

表1 提取次数对提取效果的影响

2.3 各部位虾青素含量的测定结果

通过上述的单因素实验得出的最佳提取方法来测定草海4个样地小龙虾虾壳、虾肉和内脏中的虾青素含量，结果如表2所示，草海小龙虾虾青素在4个样地虾壳中含量最高，西海码头(45.28±0.12 μg·g-1)、江家湾(38.24±0.14 μg·g-1)、吴家岩头(46.18±0.23 μg·g-1)、喽啰山(42.97±0.26 μg·g-1)，4个样地虾肉和内脏中也含有少量虾青素，但是含量远低于虾壳中的含量，这也说明了小龙虾虾青素主要富集在虾壳中。

表2 4样地小龙虾不同部位的虾青素含量

3 结论与讨论

目前，虾青素提取工艺的研究已经取得了很大的进展，但是对于小龙虾野外种群虾青素的研究国内外报道相对较少。宋庆洋[16]等对潜江市小龙虾虾青素研究结果表明潜江小龙虾虾壳中虾青素含量达到148.2 μg·g-1。孙来娣[17]等从南极磷虾虾粉中提取虾青素的实验结果显示，虾粉中虾青素含量为179.21 μg·g-1，比本研究中草海小龙虾虾青素含量高，这可能是与两地间环境因素有关；何立坚[8]等对明虾虾壳中虾青素的研究结果显示，明虾虾壳中虾青素含量为38.285 μg·g-1；徐煜[9]等从雨生红球藻中提取虾青素的实验结果显示，雨生红球藻中虾青素的实际含量测定值为2.896%；陈西广[6]等对海虾虾壳中虾青素进行提取，实验结果表明海虾虾壳中虾青素含量为45.5 μg·g-1，与本研究中草海小龙虾虾青素含量基本一致，说明除环境因素外，虾类水产品虾青素含量可能相差程度不大。

笔者对贵州草海自然水域的小龙虾不同部位虾青素含量、虾青素提取条件进行了研究，单因素实验结果显示，虾壳中虾青素的最佳提取条件为：用乙酸乙酯为浸提溶液，料液比为1∶2，置于60 ℃下提取2 h，重复提取两次，在此条件下得到最佳提取效果。在虾壳、虾肉和内脏各部位虾青素提取含量看，虾壳中虾青素的含量最高，4个样地虾壳中虾青素含量分别为西海码头(45.28±0.12 μg·g-1)、江家湾(38.24±0.14 μg·g-1)、吴家岩头(46.18±0.23 μg·g-1)、喽啰山(42.97±0.26 μg·g-1)，4个样地虾肉和内脏中也含有少量虾青素，但是含量远低于虾壳中的含量，这也说明了草海小龙虾虾青素主要富集在虾壳中。