石油烃对海洋生物的毒性

，，，，

(1.中国海洋大学 水产学院 海洋渔业系，山东 青岛 266003；2.威海市渔业技术推广站，山东 威海 264200)

近年来海上溢油事故不断发生，不仅造成直接的经济损失，还造成了严重的生态损失，海洋环境遭到破坏，海洋生物遭到损伤和死亡。由于石油的种类不同、组成成分不同、分子量的大小不同，这就导致了石油污染对海洋生物产生的危害程度不同。很多学者通过试验证明不同种类的海洋生物对于石油等污染物的承受能力是不相同的[1]，国内外学者在石油污染对海洋生物毒性效应方面做过大量研究[2-6]，获得了一些基础的数据，但海洋生态系统复杂生物种类繁多，仍远远不能够满足实际的需求。田丽粉[7]选用胜利原油作为污染物，褐牙鲆仔稚鱼作为研究对象，在急性毒性试验中得出胜利原油对褐牙鲆仔鱼的96 h LC50为1.194～4.15 mg/L ，对稚鱼的96 h LC50为7.87～11.86 mg/L。同一种油类污染物在对同一种生物不同阶段所产生的影响也是不相同的，发育较好的个体抵抗力强，自我调节能力强；相反个体发育不完全的仔稚鱼受到的影响就特别严重。吴彰宽[8]等试验结果表明，对于中国仔虾而言，石油对其的毒性效应为汽油和煤油>轻柴油>原油，说明石油等的污染物的毒性大小与其分子量有重要的关系，由于分子量越低的污染物越容易溶于水，而分子量越高的组分越不容易溶于水，分子量越低的组分越起到了制毒因子的作用。从众多学者的研究中可以发现，石油对海洋生物的毒性效应受生物种类、生物所处的阶段、石油污染物的分子量等多方面因素的影响，更多基础数据需要进一步研究。因此需要通过试验的方式，增加海洋生物的种类，对受污染的海洋生物数据进行完善。

石油等污染物对于海洋生物的危害主要分为短期影响和长期影响，分别对应污染物的急性毒性和慢性毒性。一方面，石油类污染物会直接对海洋生物造成急性影响，直接造成海洋生物死亡。石油中含有大量的烷烃、芳香烃、环烷烃等与水难溶的部分，在海面扩展，形成油膜覆盖在海面，隔绝了与外界的气体交换；与海水相溶的部分，油滴容易随水黏附在鱼体表面和鳃，造成鱼类呼吸障碍，特别是高分子化合物造成的窒息效应危害最大。一般轻油油膜在海面的残留大约十天的时间[9]，特别是石油污染比较严重的事故，海面上油膜会长时间、大面积的存在，溢油量在1 t左右所产生的油膜就可以达到接近12 km2的海面[10]。另一方面，石油类污染物会缓慢地对海洋生物造成影响，石油的脂溶性较好，进入海洋生物体内发生积累，当生物体内积累了一定体积，达到一定浓度时，会对生物的代谢系统发生危害，容易发生突变、致病，对发育不完全的个体造成畸形[11-12]。夏斌[13-14]认为石油污染对生物体造成的损害主要体现在膜脂过氧化和DNA链断裂等，主要是由活性氧的自由基作用引起的，污染使得机体抗氧化防御系统的清除能力赶不上生物体产生活性氧的速度。SOD、GPX和AKP是机体生物化学反应的重要物质，其酶活的改变比较容易检测出来，这一生化指标能够快速而灵敏地反映污染物造成的环境因素对生物体的影响[15]。本试验以大泷六线鱼(Hexagrammosotakii)、红螺(RapanabezonaLinnaeus)、三角褐指藻(PhaeodactylumtricornutumBohlin)为代表研究了0号柴油对海洋鱼类、贝类及浮游生物的急性毒性致死率，以及对缢蛏(Sinonovaculaconstricta)的慢性毒性对SOD、GPX和AKP三种酶活性的影响。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验生物有大泷六线鱼、红螺、缢蛏、三角褐指藻。大泷六线鱼来自烟台市某养殖场，平均体长2.6 cm；红螺、缢蛏从青岛团岛农贸市场购买，缢蛏平均壳长4.6 cm，红螺平均壳高3.6 cm；三角褐指藻由中国海洋大学微藻试验室培养，选择活力好，大小均匀的个体在试验室进行短期培养。

1.2 母液配置

1.2.1 过滤海水 为了模拟真实的海水条件，取青岛附近近岸天然海水，经沉淀池沉淀48 h及砂滤后备用，盐度为31‰，pH为7.5。

1.2.2 配置母液 按照1∶9配比将0号柴油和过滤海水混合，采用气泵充气搅拌器的方法进行24 h的搅拌，12 h的静置，采用虹吸法将液相分离，取下层海水作为母液储存于母液瓶中。参照《海洋监测规范》(GB 17378-2007)[16]采用紫外分光光度法测定母液的石油烃浓度。

1.2.3 试验液配置 根据张爱君[17]试验中试验液24 h后浓度几乎不变，48 h后降低幅度在10%以内的特点，采取24 h更换一次试验液。根据预试验确定每个试验对象的浓度范围，设置合理的浓度梯度，采用稀释母液的方法配置不同浓度的试验液。

1.3 实验方法

1.3.1 毒性试验 大泷六线鱼、红螺的毒性试验在预试验基础之上，选用40 L玻璃水箱，设置大泷六线鱼毒性试验为1个空白对照组和6个试验组，试验组浓度分别为0.86、2.59、4.31、8.62、17.25、21.56和34.50 mg/L；设置红螺毒性试验为1个空白对照组和6个试验组，试验组浓度分别为81、101、135、203、405 和810 mg/L；各组分别设置一平行组，试验在自然光照下进行，水温为22±1 ℃，适当充气，在试验过程中，每间隔3～4 h观察个体的活动状态，及时捞出死亡个体并进行及时处理。周期为96 h，其中每24 h更换一次试验液，每隔12 h统计一次受试个体死亡数目。

三角褐指藻的毒性试验选用250 mL三角瓶，把处于对数生长期的三角褐指藻放入添加母液的f/2的培养基中，在光照培养箱中培养，培养过程光照强度2 000 lx，光暗周期比12∶12，温度22±0.5 ℃，每隔3～4 h摇动三角瓶一次，整个过程要灭菌处理，周期144 h。每隔24 h用血球计数板统计一次数量。

缢蛏的毒性试验选用80 L玻璃水箱，每个水箱中放置缢蛏个体80只，试验设置空白对照组一组和0.1、0.5 和2 mg/L三个浓度组；水温控制在17±1 ℃，进行适当的充气，定期投喂，每24 h更换一次试验液，分别在暴露1 d、3 d、5 d、7 d、11 d、15 d、19 d、23 d、27 d、30 d时每组取6个样，对样品的肌肉软体组织进行解剖并编号，放入-80 ℃冰箱保存。

1.3.2 样品处理 用电子天平准确称取0.5 g缢蛏软体组织，剪碎，置于离心管中，加入9倍生理盐水，用匀浆机制成10%的匀浆组织，转移至2 mL离心管中，在4 ℃条件下离心(3 000 r/min，离心15 min)，取上清液，采用考马斯亮蓝法测定蛋白含量，SOD、AKP、GSH-PX的测定按照试剂盒方法进行，试剂盒购买自南京建成生物有限公司。

1.3.3 数据处理 方差分析：本试验采用SPSS22进行单因素方差分析，P≤0.05时差异显著；P≤0.01时差异极显著，P>0.05时则差异不显著。

关系方程：将油分散液浓度和生物毒性效建立“浓度一效应”方程，P(C)取5时求出的浓度为LC50半致死浓度(EC50半抑制浓度)：

P(C)=K×lg(C)+d

P(C)为死亡率所对应的概率单位；K为直线方程的斜率；C为石油浓度；d为直线方程的截距。

安全阈值浓度[18]：C(安全阈值)=96 h LC50×0.1

死亡率：死亡率=死亡数/受试个体数×100%

抑制率：抑制率=1-(Ntn-Nt0)/(Ncn-Nc0)×100%

Ntn为处理组第n次测定时藻类细胞数，Nt0为处理组初次测定时藻类细胞数，Ncn为对照组第n次测定细胞数，Nc0为对照组初次测定细胞数。

2 结果与分析

2.1 急性毒性试验

2.1.1 大泷六线鱼毒性效应分析 试验周期内对照组未出现异常症状，试验初期中高浓度组鱼躁动不安，游速加快，不规律游动，高浓度组更为明显；随后游动逐渐缓慢，侧游或飘于水面，呈半休克状态，死亡时体表黏液增多，鳃部充血。各个浓度死亡率如图1所示，暴露24 h时34.50 mg/L组死亡率已经高达40%；随时间不断增加，34.50 mg/L与21.56 mg/L的高浓度组后期全部致死，17.25 mg/L组死亡率也达到了90%左右；8.62 mg/L和4.31 mg/L中浓度组死亡率达到50%和40%，未死亡个体呼吸微弱反应极为迟钝；低浓度组个体试验初期没有出现不正常反应，个体没有死亡，试验临近结束有少量死亡。从图像整体来看，大泷六线鱼的死亡率与试验液浓度、暴露时间呈正比。

2.1.2 红螺毒性效应分析 在试验初期，所有试验组红螺厣紧闭，试验组的红螺均出现分泌大量黏液的现象。对照组与低浓度组的部分个体附着在玻璃水箱壁，随着试验的进行，高浓度组有红螺露出水面，反应迟钝，逐渐出现死亡个体，死亡个体按压厣不能收回并出现异味，死亡个体肉质变软无弹性，镜检附着有油滴。如图2所示81 mg/L和101 mg/L的低浓度组试验前36 h没有死亡现象出现，48 h之后个别个体死亡；中高浓度组在试验前期就出现个体死亡现象，随试验时间延长死亡率增加，试验在60 h时405和810 mg/L浓度组死亡过半，此后死亡速率逐渐增加，96 h 时810 mg/L浓度组死亡率达100%，405和203 mg/L浓度组死亡率已经达到95%和80%，其中未死亡个体，厣紧闭，触碰反应极为迟钝已呈假死状态。

图1 0号柴油对大泷六线鱼死亡率影响

图2 0号柴油对红螺死亡率影响

2.1.3 三角褐指藻毒性效应分析 刘娜等[19]认为低浓度石油烃胁迫下小球藻生长受抑制不明显，高浓度石油烃胁迫下小球藻不全死亡。本试验在预实验中得出低浓度的石油烃对三角褐指藻有刺激作用，高浓度石油烃对其生长有抑制作用。根据预实验结果设置1.86、3.72、4.65、6.2、9.3和18.6 mg/L六个试验组和一个对照组进行试验，如图3所示，对照组三角褐指藻细胞密度呈指数快速增长，各浓度组对三角褐指藻生长均有抑制作用，24 h时抑制效应开始逐渐明显，但各个浓度组差异不大，随暴露时间增加，其抑制效应增强，各浓度组间差异明显，整体上随浓度升高，抑制效应增强。除18.6 mg/L浓度组在48 h后细胞密度基本没有上升之外，其他浓度组的细胞密度始终处于增长状态。石油烃对以三角褐指藻为代表的藻类抑制作用明显。

图3 0号柴油对三角褐指藻的生长影响

2.1.4 半致死浓度及阈值分析 0号柴油分散液对大泷六线鱼、红螺及三角褐指藻的半致死浓度(半抑制浓度)如表1所示。由于三种受试生物均呈现出随时间增加半致死浓度值减小的规律。为了进一步探讨时间与半致死浓度之间的关系，以时间为自变量，LC50(EC50)为因变量建立散点图，对其进行自动拟合如图4所示。发现两者具有二次线性关系，大泷六线鱼LC50与时间的关系y=0.003 3x2-0.728 6x+43.768，R2=0.998 8；三角褐指藻EC50与时间的关系y=0.001x2-0.248 6x+19.184，R2=0.976 6；由此可以看出两者具有较好的二次线性关系，这与刘娜[19]分析石油与小球藻的EC50结果相似，廖国祥[20]在分析“时间-效应”关系中提出过LC50与暴露时间存在对数关系，一般急性毒性实验以96LC50(EC50)作参考测定污染物毒性，很少考虑其他时间对受试生物的致死情况，但此关系的建立可以在溢油事故损害评估中推测其他时间的毒性效应，为溢油事故损害评估提供基础的数据关系。

图4 LC50(EC50)与时间的关系

受试生物时间回归方程相关系数(R2)LC50/EC50/mg·L-1安全阈值/mg·L-1大泷六线鱼红螺三角褐指藻24 hy=1.657 7 x+2.271 30.976 544.2748 hy=1.869 2 x+2.619 10.970 518.7972 hy=2.083 9 x+2.749 40.964 812.0296 h y=2.399 2 x+3.433 20.879 34.5048 hy=1.441 3 x+1.003 40.948 9595.6072 hy=1.792 6 x+0.757 40.977 5232.2096 h y=3.206 4x-1.456 90.973 9102.3024 hy=1.094 x+3.765 70.909 313.4348 hy=1.045 4 x+3.935 60.967 010.4772 hy=1.091 7 x+4.207 20.958 05.3296 h y=1.138 9 x+4.308 20.964 24.05120 hy=1.132 9 x+4.385 0.865 93.48144 hy=1.152 2 x+4.435 40.980 33.000.4510.23/

2.2 慢性试验毒性分析

2.2.1 石油烃对AKP活性影响 如图5所示0.1 mg/L为低浓度组、0.5 mg/L为中浓度组、2 mg/L为高浓度组。在整个试验过程中对照组的AKP活性基本稳定，且活力值较高。低浓度组在受到油类污染物1 d后AKP活性被诱导其活性升高，在5 d后达到峰值，此后AKP活性降低，在前15 d内活性显著高于空白对照组(P<0.05)，之后活性相对稳定，与对照组差异不显著(P>0.05)，呈现先升高再降低后平稳的规律。中浓度组AKP活性在1 d后同样受到油类污染物诱导而升高，并显著高于对照组，随后其活性不断降低，7 d之前下降幅度较大，7 d之后下降幅度有所减小；高浓度组AKP活性在1 d之后就受到抑制，1 d到3 d活性大幅下降，随后进行不同程度的下降，总体呈现下降趋势。将曲线对比来看，低浓度的石油烃类污染物对于缢蛏AKP活性有一定的诱导作用，高浓度的石油烃类污染物则会抑制缢蛏AKP活性，对其造成伤害，且与对照组相比差异显著；对AKP活性的诱导作用会随时间逐渐减弱；抑制作用随着浓度的升高作用越来越强。

图5 0号柴油对缢蛏AKP活性影响

2.2.2 石油烃对SOD活性影响 不同浓度石油烃对缢蛏SOD活力影响结果如图6所示，空白对照组在试验期间酶活性正常没有出现特殊变化；低浓度组1 d到3 d内 SOD活性与对照组无显著性差异(P>0.05)，3 d开始SOD活性开始高于对照组，并且活性缓慢升高，但差异不显著(P>0.05)。中浓度组前5 d缢蛏SOD活性出现持续升高的现象，与对照组相比差异极显著(P<0.01)，5 d时SOD活性到最大值，之后酶活性开始减弱，直至11 d减弱到与对照组持平，之后活性继续减弱，直到19 d之后活性基本保持不变；高浓度组在前3 d SOD活性迅速升高达到最大值，与对照组差异极显著(P<0.01)，之后SOD活性迅速减弱，直至7 d与对照组相比显著减弱(P<0.05)，之后活性呈现缓慢下降趋势。通过对整体图线的分析，发现整体上缢蛏肌肉组织SOD活性呈先上升再下降后平稳的趋势，且浓度越高，活性的最高值出现越快；三个浓度组与对照组相比出现了低浓度诱导，高浓度抑制的规律，之后都随时间延长受到抑制，活性受到不同程度减弱。

图6 0号柴油对缢蛏SOD活性影响

2.2.3 石油烃对GSH-PX活性影响 石油烃污染物对缢蛏体内GSH-PX活性的影响试验结果如图7所示，空白对照组在试验期间酶活性正常没有出现特殊变化，从试验1 d开始，各浓度组GSH-PX活力均大于空白对照组，各组呈现不同的发展趋势，中高浓度组与对照组有显著性差异(P>0.05)；低浓度组酶活性在升高到7 d后达到最高，随后缓慢降低，与空白对照组相比无显著性差异；中浓度组在5 d内酶活性逐渐升高，与空白对照组有显著性差异(P>0.05)，在5 d升至最高之后到11 d呈明显下降趋势，之后趋于稳定；高浓度组在试验进行3 d内GSH-PX活性迅速升高，3 d之后进行急速下降期，在试验期间持续下降。由试验结果可知，石油烃污染物对缢蛏GSH-PX有一定的诱导效应，浓度越高诱导的活性最高值出现越快，随后其活性呈现不同程度的下降，浓度过大会出现抑制效应，且浓度越大抑制效应越明显。此试验得出产生抑制效应的阈值在0.1～0.5 mg/L。

3 讨论

通过0号柴油对三种海洋生物急性毒性试验的测定，0号柴油对大泷六线鱼、红螺、三角褐指藻96LC50(EC50)分别为4.499、102.3和4.05 mg/L，从试验数据和结果来看不同种类海洋生物对石油烃的耐抗性差异很大，这可能由于各生物种类的自身结构不同，自我调节能力不同，生活习性不同等因素。本试验通过对代表海洋生物的毒性研究得出海洋生物对0号柴油耐受性的大小顺序为贝类>鱼类>浮游生物。贾晓平[21]测定了南海原油、0号柴油和20号柴油对多种仔虾、仔鱼和贝类的急性毒性。通过试验得出的耐受能力顺序为:贝类>鱼类>虾类，本试验与其测定结果类似。

表2 鱼类急性毒性试验毒性分级标准

图7 0号柴油对缢蛏GPX活性影响

0号柴油对以大泷六线鱼为代表的鱼类毒性相对较大。根据表2鱼类毒性的分级标准，由于0号柴油起始LC50在1～100范围内属于高毒性污染物，对鱼类破坏较为严重。究其原因是对于鱼类石油烃污染物会直接附着于鳃丝和体表，使鱼体的呼吸系统受到侵害，体表黏膜受到破坏，鱼体更易受到侵害；红螺为了对自身进行保护和调节，前期紧闭厣，减少了低浓度石油烃污染物的侵害。从0号柴油分散液对三角褐指藻的作用来看，相对鱼类和贝类，海洋微藻更易受石油污染的影响。有研究表明，低浓度石油烃污染物能够促进微藻的生长和繁殖，进而产生赤潮、水华等现象，然而石油浓度过高又会抑制微藻的生长，作为初级生产者的藻类特别容易受到侵害，同时也通过食物链食物网进而影响其他海洋生物，对整个海洋生态系统造成巨大的损害。

从石油烃污染物对缢蛏的慢性毒性试验来看，SOD、GSH-PX作为抗氧化酶的重要组成成分，在生物体内具有重要意义，通过清除多余活力自由基，来调节和维持生物体内活力自由基的平衡，使得自由基的浓度保持合理的浓度范围，避免生物体受到损害[22]。AKP在软体动物中起到了非常重要的作用，作为一种重要的代谢调控酶，作用于壳角蛋白质的合成过程，作为溶酶体酶的组成部分，对生物体的免疫也起到了非常重要的作用[23]。缢蛏受到低浓度0号柴油为代表的污染物影响时，体内活性氧迅速增加，为了减少活性氧，SOD、GSH-PX会随着升高，在自我保护和调节范围之内，从而对生物体产生一定的诱导作用[24]。试验中石油烃对AKP、SOD、GSH-PX三种酶均呈现出诱导现象，超出机体承受范围后，机体受损，酶活性降低。已经有很多研究表明有机污染物例如多环芳烃等对水生生物免疫功能产生不同程度影响[25-27]，石油烃浓度过高或生物体受石油污染胁迫时间过长，破坏机体调节机制，使得酶活性降低。目前为止石油污染对缢蛏酶活性探究较少，但石油烃对其他贝类酶活研究不少，有研究表明，在低浓度石油类多环芳烃污染物影响下贻贝体内SOD、CAT和GSH-PX活力会升高[28]。通过试验得出海洋石油烃的污染对于海洋生物的损害不仅是急性的、短期的，也存在长期的、慢性的危害，海洋生物长期处于高浓度的受污染海水中，各种酶活性会发生改变，导致机体自身代谢和自我调节发生紊乱。通过石油烃对缢蛏SOD、GPX、AKP三种酶活性的试验可以看出不同浓度的石油烃污染物会不同程度地对三种酶产生影响。AKP对于石油烃污染物较为敏感，短时间内诱导之后就产生强烈的抑制反应。从三种酶活性来看，整体呈现出低浓度诱导、高浓度抑制的现象，这一结果对于研究海洋污染对于海洋生物的危害程度起到了很好的参考作用。今后对于海洋生物危害的研究方向主要在于进一步完善生物毒性数据，建立毒性数据库，形成一套完整的污染程度鉴定指标体系，为实际的溢油事故提供理论依据。