镇肝熄风汤对SHR大鼠Ang II 1型受体蛋白和mRNA表达的影响

谢 鑫，陈 磊，苗嘉芮，吴成举，刘文俊，陈 靖，张立德

(1.辽宁中医药大学，辽宁 沈阳 110032；2.辽宁中医药大学杏林学院，辽宁 沈阳 110032)

现代生活压力以及国际化进程，造成精神压力过大，很多原发性高血压患者临床表现为：肝阳上逆、肝阳亢逆无所制，气火上扰，从而引起头目胀痛，急躁易怒，心悸健忘，面红目赤等症状。这些症状属于肝阳上亢型高血压，需要“镇肝息风，滋阴潜阳”对症治疗。镇肝熄风汤摘录于《医学衷中参西录》，用于治疗肝阳上亢，气血上逆证型自发性高血压，具有显著的降低血压疗效。血管结构变化是高血压疾病的重要改变。血管紧张素原(Angiotensin，Ang)是一种肽类物质，具有血管收缩功能，同时刺激肾上腺皮质分泌醛固酮的功能，醛固酮促进远曲小管和集合管上皮细胞Na+重吸收和排放K+，促进体内Na+和水的储留[1～3]。体内血管内容量血液增多以及强烈的血管收缩，导致血压升高。Ang有七个亚型，分别为AngⅠ、AngII、AngIII、AngⅣ、AngⅤ、AngⅥ、AngⅦ，其中Ang II具有收缩血管功能作用，是血管紧张素家族中作用最强的分子因子；而Ang II 1型受体(Angiotensin II Type 1 Receptor，AT1R)是Ang II产生血管收缩功能最重要的受体[4，5]。本实验采用自发性高血压大鼠(Spontaneously Hypertensive Rats，SHR)，用中医经典古方镇肝熄风汤，来观察对SHR大鼠的腹主动脉AT1R蛋白表达和AT1R mRNA表达的影响，揭示镇肝熄风汤对肝阳上亢型SHR大鼠降低血压的生物学机制。

1 材料与方法

1.1动物2016年3月至2017年12月，选择SPF级别 SHR大鼠 60 只，健康雄性 24 周龄；12只 SPF 级别，雄性魏-凯二氏大鼠(Wistar-Kyoto rats，WKY)，体重量为：(200±15)g，实验动物许可证号为：SCXK(京)2016-0011，采购于北京维通利华实验动物技术有限公司；大鼠饲养条件为：室温 21-26 ℃，相对湿度 46%～56%。采用随机数字表方法将SHR大鼠分成 5 组各12只：模型组、镇肝熄风汤低剂量组、镇肝熄风汤中剂量组，镇肝熄风汤高剂量组；复方罗布麻组；12 只WKY大鼠(健康同源雄性)作为正常组。

1.2药物与试剂镇肝熄风汤：生代赭石30g(先煎)、甘草5 g、黄芩15 g、牛膝30 g、生牡蛎15 g(先煎)、川芎15 g、生地15 g、栀子15 g、白芍20 g、生龙骨15 g(先煎)、玄参15 g、炙龟板15 g(先煎)、丹参20 g、白术10 g、钩藤15 g、茯苓10 g等；辽宁中医大学附属医院药店采购实验中所用的中药药材(产地山东)，由张林老师(辽宁中医药大学基础医学院方剂教研室)鉴定：中药药材均为合格正品；常规煎煮水提中药药材，每副中药加水8倍量约为：1400 mL，中药浸泡时间为：30 min，其中生牡蛎、炙龟板、代赭石、生龙骨先煎为：30 min，再加入镇肝熄风汤药方中其余的中药药材，再次煎煮时间为：30 min；中药煎好后，用无菌纱布(10 层)过滤，收集中药药液。一抗兔抗大鼠AT1R抗体(美国Abcam company公司)；二抗羊抗兔辣根过氧化物酶标记(Horse Reddish Peroxidase，HRP；日本TaKaRa公司)；复发罗布麻片I(国药准字：14022937，亚宝药业集团股份有限公司)；AT1R引物：上游5’-TCAACCTCTACGCCAGTG-3’，下游 5’e-CAAGCCAGCCATCAGC-3’，GAPDH引物：上游5’-TCGGACGCCTGGTTAC-3’，下游5’-TTCCCATTCTCAGCCTTG-3’，RT-PCR 试剂盒(日本TaKaRa；批号：RR014 A)；实时定量试剂盒(日本TaKaRa；批号：RR014 A)；PCR扩增仪(美国ABI 公司；型号：9700)；核糖核酸提取试剂盒(美国Abcam company公司，货号：15596026)。

1.3给药方法按照人体和大鼠体表面积比换算[6]，SHR大鼠给药等效剂量为：SHR大鼠药物剂量=X mg/kg×70 kg×0.018/200 g=X mg/kg × 70 kg × 0.018/0.2 kg=6.3 X mg/kg =(172/60)×6.3=18.06 g/kg，镇肝熄风汤低剂量组、中剂量组和高剂量组用药剂量分别为：18 g/kg、40 g/kg和80 g/kg，根据公式换算成中药浓度为：1 g/ml/2 g/ml，4 g/ml，复方罗布麻片悬浮液组为：80 g/kg，根据公式换算成中药浓度为：0.02 g/ml，4 ml/d。给予每只大鼠灌胃模型对照组给予0.9% 氯化钠溶液、小剂量组给予镇肝熄风汤 18 g/kg、中剂量组给予镇肝熄风汤 40 g/kg，高剂量组给予镇肝熄风汤80 g/kg；阳性对照组给予 80 g/kg；正常对照组给予0.9% NaCl 溶液。连续灌胃给药45天，早晚各一次。

1.4WesternBlotting检测每组大鼠取1～2 cm标本(主动脉弓下段的腹主动脉)，每个样本使用PBS(美国Thermofisher公司，产品号：10010031)冲洗，冲洗后，总蛋白裂解液(美国Thermofisher公司，产品号：78510)加入每个样本中，使用匀浆机进行组织匀浆(操作均在冰块中进行)；每个样本总蛋白定量：使用牛血清蛋白(酚试剂方法)：在波长为650 nm条件下，测得每个样本的OD值(722分光光度计)；根据每个样本的OD值，把每个标本配成相同体积和相同浓度；把Running Buffer(美国Thermofisher公司，产品号：NP0001)加入所有的标本中，在100 ℃沸水中，使每个样本中的蛋白变性(煮沸时间为：5 min)；每个样本加样进行跑胶(分离胶和浓缩胶跑胶)；取出跑完的胶，将胶体放入转印槽中进行转印(将变性的蛋白转印到硝酸纤维素膜上)；转印完毕后，取出转印膜(硝酸纤维素膜)，2 h(5%，伊利脱脂奶粉)封闭转印膜，封闭后使用TTBS(美国invitrogen公司，产品号：9404)进行清洗(2次，每次5 min)，清洗后转印膜中加入1：1000稀释的一抗(美国Abcam company公司)，再加入1：350稀释的二抗(日本TaKaRa公司)，把加入一抗和二抗后的转印膜放入平皿中，使用TTBS(美国invitrogen公司，产品号：9404)进行冲洗(2次，每次5 min)，冲洗后的转印膜，按说明书操作进行ECL发光检查每个样本中的AT1R蛋白含量。

1.5RealTimeRT-PCR测定所有的标本加入TRIzol(美国Abcam company公司，货号：15596026)试剂，室温放置5 min，使每个样本充分裂解释放总RNA，提取总RNA后，使用匀浆机进行组织匀浆(操作均在冰块中进行)，匀浆后，每个样本加入200 μl氯仿/ml(美国Amresco公司)，使用4 ℃超速离心机(美国Beckman公司，型号：L-80XP)：12000×g，离心15 min，吸取每个样本的上清液(弃沉淀)，加入0.5 ml异丙醇/ml(美国Amresco公司)摇匀；摇匀后，使用4 ℃超速离心机：12000×g，离心15 min，弃每个样本EP管的上清，提取的总RNA沉于EP管底部；加入75% 1 ml乙醇/ml，进行摇匀，使用4 ℃超速离心机：12000×g，离心15 min，再次弃掉每个样本EP管中的上清液；Nuclease free water(美国Abcam company公司，货号：AM9937)试剂加入每个样本中。260 nm、280 nm波长测定每个样本的OD值(紫外可见光分光光度计)；测定后，根据测定每个样本的OD值，把每个样本配成相同体积和相同浓度，按说明书操作加入RT-PCR(日本TaKaRa；批号：RR014 A)试剂盒中的试剂，使每个样本中提出的mRNA逆转录合成cDNA，再加入Real-time PCR(日本TaKaRa；批号：RR014 A)试剂盒中的试剂，按说试剂盒中的明书，进行样本的实时定量PCR 扩增操作。

1.6统计学方法实验数据使用SPSS 13.0 统计软件分析，选用ONE WAY ANOVA方法进行统计学分析结果，以均数±标准差表示各组数据。P< 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1WesternBlotting结果与模型组比较，正常对照组、镇肝熄风汤中剂量、高剂量和复方罗布麻组中AT1R蛋白表达明显降低(F=863.465，P< 0.01)。见图1，图2。

图1 AT1R 和GAPDH 蛋白表达

图2 AT1R/GAPDH 灰度值比较 *与模型组比较，P < 0.01 A：正常对照组；B：模型组；C：镇肝熄风汤低剂量组；D：镇肝熄风汤中剂量组；E：镇肝熄风汤高剂量组；F：复方罗布麻组

2.2RealTimeRT-PCR结果与模型组比较，正常对照组、镇肝熄风汤中剂量高剂量和复方罗布麻组中AT1R mRNA的表达明显降低(F=863.465，P< 0.01)。见图3。

图3 AT1R/GAPDH mRNA扩增比值 *与模型组比较，P < 0.01 A：正常对照组；B：模型组；C：镇肝熄风汤低剂量组；D：镇肝熄风汤中剂量组；E：镇肝熄风汤高剂量组；F：复方罗布麻组

3 讨论

现代快速生活节奏，造成高血压疾病的患者日益增多，其中高血压疾病分为两种：原发性高血压和.继发性高血压，原发性高血压占高血压疾病的90%以上[7～9]。血压升高最起始影响的原因是血管收缩的改变，血管收缩最重要的影响因子是Ang II，引起Ang II收缩血管生物学效应的最重要的受体是AT1R，大量实验研究表明，Ang II与AT1R结合，产生强烈的血管收缩效应[10～12]。Ang II与AT1R结合后，使AT1R活化后，通过激活磷脂酶C和增加细胞内Ca+浓度，引起强烈的收缩血管作用，同时刺激醛固酮合成和分泌，增加体内的Na+和水的储留，有效的提高体内的循环血量，进一步的提高收缩血管带来的高血压的生物学效应[13～16]。

镇肝熄风汤出自《医学衷中西参录》，其药方成分作用：牛膝生代赭石相伍，刚柔并进，重用牛膝，将随风上逆的血引而下行；生代赭石色赤而入血，石体质重而下行，平定上逆之挟血肝风；牡蛎、龙骨和龟板合用，具有滋阴潜阳的作用；牡蛎为水中之物，入药将浮越之阳潜降于水中[17]。经典中药方镇肝熄风汤是具有“镇肝熄风，滋阴潜阳”的功效，显著有效的治疗肝阳上亢型自发性高血压，改善头目眩晕、目胀耳鸣、心中烦热、脉弦长有力、肢体渐觉不利、眩晕、精神萎靡等临床症状。

镇肝熄风汤可以调低SHR大鼠腹主动脉血管组织中AT1R蛋白表达和AT1R mRNA 表达，减少SHR大鼠的血管收缩能力，起到有效降低SHR大鼠血压作用。