东北褐环乳牛肝菌多糖提取及抗氧化活性研究

柴军红，何婷婷，于薇

(牡丹江师范学院，黑龙江 牡丹江 157012)

褐环乳牛肝菌主要分布于中国的东北、西南的松林或混交林地上，国外日本、欧洲及北美也有分布，是口感不错的食用野生菌[1-2]。褐环乳牛肝菌富含多种氨基酸，维生素B族，粗纤维，多糖等[3-4]。其香气成分中含松茸醇，异松茸醇，桂皮酸甲酯等组成其主要的风味成分[3]。此外，还含有多酚、黄酮及皂苷类化合物[5]。食用菌多糖具有安全性高、功能性强的特点，具备显著免疫调节、抗病毒、抗氧化等活性是食用菌研究热点之一[6]。近年来褐环乳牛肝菌主要围绕生境、共生、培育及发酵生产等做了大量工作，诸如：员子晶等[7]、尹大川等[8-9]等研究松根际土壤关系及共生；李敏等[10]研究了发酵生产优化的等。此外也有一些分子方面研究，对于清除自由基研究，主要有刘刚，刘品华团队做了一些比较研究[11-12]。

人体内自由基以氧自由基为主，多数自由基可以破坏核酸及染色体、干扰细胞代谢、结合破坏蛋白质和酶体系，从而加速机体的衰老[13]，可直接或间接引起慢性疾病及衰老效应[14]，所以补充抗氧化物质具有好的临床及保健价值。褐环乳牛肝菌中含有多肽类、多糖类等，本文以黑龙江地区产的褐环乳牛肝菌为对象，希望为其开发提供一些理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料

褐环乳牛肝菌：采自牡丹江地区，经过牡丹江师范学院曲秀春教授鉴定为褐环乳牛肝菌。

1.2 主要试剂

R-10纤维素酶，Y-23果胶酶(BR，美国Sigma公司)，DPPH(优级纯，美国Sigma公司)，邻苯三酚(AR,上海展云化工有限公司)，七水硫酸亚铁(AR，天津博迪化工股份有限公司)，无水乙醇(AR，天津进丰化工有限公司)，食用酒精(95%，本地酒厂)，1,10-菲罗啉 (AR，瓦里西化工)，L-抗坏血酸(AR,上海埃彼化学试剂有限公司)，30%双氧水、盐酸(AR，哈尔滨试剂厂)等。

1.3 主要仪器

JJ-2型组织捣碎机匀浆机(武汉世纪超杰实验仪器有限公司)；SL-2010N超声波萃取装置(南京顺流设备有限公司)；T6紫外可见分光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)；BSA224S-CW电子天平(德国赛多利斯集团)；LGJ-18S冷冻真空干燥机(郑州鸣一仪器设备有限公司)；PB-10酸度计(德国赛多利斯集团)等。

1.4 实验方法

1.4.1 多糖提取。取1000g褐环乳牛肝菌用组织捣碎机破碎，以纯水为提取剂，依据每100g固体加入1%果胶酶、2%纤维素酶，控温37℃，pH在6.5下酶促处理2h；微波灭活；以固液比1∶10，功率600W，超声波提取60min，提取2次[14]，合并滤液，浓缩至原体积1/10，sevage法除去蛋白，-70℃预冻8～12h，冷冻干燥备用。

1.4.2 多糖抗氧化研究。样品液制备：精确称取1.000g多糖的，配制成10mg/mL的提取物溶液作为母液。用母液分别配制2.0 mg/mL 、1.0 mg/mL、0.8 mg/mL、0.6 mg/mL、0.4 mg/mL、0.2 mg/mL的溶液[15]。

维生素C溶液现用现配。

1.4.2.1 超氧自由基清除能力测定：依据文献方法[16-17]采用邻苯三酚自氧化测定超氧自由基清除能力，总时间控制在3.5min内，并依据以下公式计算。

清除率(%)=[(C0-C1)/C0]×100

C0(自氧化)：自氧化时吸光度随时间变化

C1(样品，维生素C)：加入样品液后吸光度随时间变化

1.4.2.2 羟基自由基清除能力测定：依据文献[15,17]，方法略有改变，在510nm，采用菲罗啉- FeSO4- H2O2体系研究羟基自由基清除能力，并依据以下公式计算。

清除率(%)=[1-(Q1-Q2)]/[Q3-Q2]×100

Q1：样品(维生素C)+邻二氮菲- FeSO4- H2O2体系溶液的吸光度；

Q2：H2O2溶液+空白样品体系溶液的吸光度；

Q3：不加H2O2和样品(维生素C)的体系溶液的吸光度。

1.4.2.3 DPPH自由基清除能力测定：依据文献方法[18-19]，略有改动，在520 nm下，暗条件反应30min，并依据以下公式计算。

清除率(%)=[1-(D1-D2)/D0]×100

D0：DPPH和95%乙醇的吸光度

D1：DPPH和待测样品(维生素C)的吸光度

D2：待测样品(维生素C)95%乙醇的吸光度

2 结果与讨论

2.1 多糖超氧自由基的清除作用

图1 多糖对超氧自由基的清除作用

依据图1结果，浓度在0.2～0.6mg/mL清除率变化较平稳,并且随着浓度升高变大，显示浓度-清除率具有相关性，0.8mg/mL清除率可达48%以上，显示一定的清除能力。

2.2 多糖对羟基自由基的清除作用

图2 多糖对羟基自由基的清除作用

依据图2结果，当浓度0.2～0.6mg/mL清除率变化较为平缓，0.8mg/mL以上出现较大变化，最终达到62%以上，显示较好清除率效果，由于羟基自由基与人体衰老有一定联系，所以多糖具有一定潜在抗衰老活性[20]。

2.3 多糖对超氧自由基的清除作用

图3 色素对DPPH自由基的清除作用

在整个实验浓度区间清除率上升较为平缓，这与文献[11-12]较为吻合，在浓度在1mg/mL时就达到28%以上，体现出一定抗氧化效果。

2.4 多糖红外测定结果

图4多糖红外光谱

依据图4其3349.42cm-1附近的强吸收峰为O-H或N-H伸缩振动峰；在2924.04cm-1处的尖峰是C-H(-CH2)伸缩振动峰；其1079.56cm-1、1026 cm-1、548.42cm-1为吡喃糖特征吸收之一[15,21]，在1652.97cm-1处的强尖峰是C=O(-CHO)的伸缩振动峰，表明此多糖为吡喃糖；578.42cm-1的弱小尖峰是β-吡喃环弯曲振动峰，通过以上结果说明多糖为β-型吡喃多糖。

3 结论

在样品测定浓度范围内，随着浓度的提升多糖对超氧自由基、羟基自由基、DPPH自由基的清除能力也逐渐增加。结果表明：其多糖对羟基自由基(·OH)的清除率为62.19%，显示出具有抗疲劳应用前景；多糖对超氧离子自由基(·O2-)的清除率最高为48.30%；其红外表征显示多糖为β-型吡喃多糖，所以多糖具有一定开发潜力及价值。