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苗族药飞龙掌血不同药用部位化学成分差异对比研究*

2019-04-20牛建均马四补刘春艳张丽艳

世界科学技术-中医药现代化 2019年12期
关键词:飞龙指纹药材

牛建均,马四补,刘春艳,张丽艳**,罗 君

(1. 贵州中医药大学 贵阳 550025;2. 贵州中医药大学第一附属医院 贵阳 550001)

飞龙掌血又名见血飞,为芸香科飞龙掌血属植物飞龙掌血Toddalia asiatica (L.)Lam.的干燥根或根皮,是贵州苗族常用药物,主要分布于贵州、云南、广西、四川、陕西等地,具有消肿解毒、化瘀止痛、止血活血、祛风除湿之功效,常用于跌扑损伤、吐血、刀伤出血、闭经、牙龈出血、口舌生疮、风湿性关节炎及风湿痹痛、胃痛、痛经等多种痛症、血症的治疗[1]。目前,国内含有此药材的制剂主要有关通舒口服液、复方复宁膏、痛可舒酊、清痹通络药酒、复方伸筋胶囊、龙掌口含液等,用于治疗骨伤和肿瘤等方面。现代研究表明,飞龙掌血中含有丰富的香豆素类成分,包括一些简单香豆素、吡喃香豆素、呋喃香豆素、双香豆素等香豆素类成分[2-4];飞龙掌血根部以及心材中含有大量的生物碱类成分[5-7];此外,飞龙掌血中含有一类重要天然单体萜类[8],是天然药物生物活性成分的重要来源。同时,黄酮类化合物是飞龙掌血中一类活性化学成分[9]。在对飞龙掌血化学成分研究的同时,国内外学者也对其药理活性做了大量研究,研究结果显示飞龙掌血具有止血凝血[10-11]、抗炎镇痛[12-13]、抗菌[14]、抗氧化[15]、抗肿瘤[16]等药理作用。

目前,对飞龙掌血质量控制方法、不同药用部位间化学成分差异研究报道较少,且各地方标准中飞龙掌血的用药部位均不尽相同。《贵州省中药材、民族药材质量标准》(2003 版)中规定,飞龙掌血的药用部位分别是叶和根皮[17];《云南省中药材标准》(2005 版)(第四册彝族药)规定飞龙掌血为其干燥茎[18];《湖南省中药材标准》(2009 版)规定飞龙掌血为干燥根[19];《广西中药材标准》第二册规定飞龙掌血为芸香科植物飞龙掌血干燥根及茎[20]。由此可见,现行各地方标准中,飞龙掌血的用药部位主要为根皮、根、茎和叶,药用部位因地区用药习惯有明显差异,然其化学成分是否有差异,研究报道较少,大多为单一部为的化学成分分析及药理研究。对飞龙掌血不同部位的化学成分差异研究的报道主要是运用HPLC 指纹图谱对其进行对比研究。有学者采用HPLC 梯度洗脱的方法,建立飞龙掌血根部和根皮部的HPLC 指纹图谱进行比较分析,并明确指认出20 个共有峰,研究结果显示飞龙掌血根部与根皮部色谱指纹图谱的整体面貌相近,但其根部色谱指纹图谱中色谱峰数目和峰面积较根皮部均有明显减少,与共有模式的相似度较低[21]。有研究者利用HPLC 建立了不同部位的飞龙掌血指纹图谱,指认出5个共有峰,并对共有峰比较分析,结果显示其药材的根、茎、叶的指纹图谱完全不一致,不同部位的药材化学成分差异明显[22]。有研究对全国不同产地的飞龙掌血药材的指纹图谱分析发现,不同产地的见血飞药材质量差别较大[23]。

表1 样品来源

飞龙掌血作为苗族药在《贵州省中药材、民族药材质量标准》的药用部位分别是其叶和根皮,为扩大根皮药源和进一步的证明标准的准确性。课题组前期对飞龙掌血根皮与茎皮进行了HPLC 指纹图谱研究[24],标定了9 个共有峰,对比分析发现两者具有相似性,然而相对峰面积差异较大,表明其相关物质活性成分的量有一定的差异。但未就其他药用部位进行对比。因此,本研究在新的研究条件下首次建立了飞龙掌血的根皮、叶和非药用部位茎皮三者的HPLC 指纹图谱,分析三者相似度、对比三者化学组成的差异,为《贵州省中药材、民族药材质量标准》中飞龙掌血药用部位划分的合理性提供理论依据,为扩大飞龙掌血根皮药源和加强中药新品种研究,促进中药资源的可持续发展数据支撑。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Agilent1260 型高效液相色谱仪(美国安捷伦公司);AUW120D 型十万分子一电子天平(日本岛津公司);KQ5200DE 声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 材料与试剂

白屈菜红碱对照品(批号111718-201402,供含量测定用),购于中国食品药品检定研究院,磷酸为分析纯,甲醇、乙腈为色谱纯,水为娃哈哈纯净水。所需药材由贵阳新天药业股份有限公司与恒霸药业有限责任公司提供,经贵州中医药大学药用植物栽培与鉴定教研室魏升华教授鉴定为飞龙掌血(Toddalia asiatica(L.)Lam.)的根皮、茎皮和叶,药材产地见表1。

1.3 评价软价

中药色谱指纹图谱相似度评价系统(国家药典委员会,2012年A版)。

2 方法

2.1 色谱条件

色谱柱:Agilent C18柱(250 mm×4.6 mm,5µm);流动相:乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B)系统梯度洗脱,程序:0-20 min,10%乙腈;20-40 min,10%-25%乙腈;40-60 min,25%-50%乙腈;60-80min,50%乙腈。检测波长:320 nm;流速:1.0 mL·min-1;柱温:28℃;体积:20µL。

图1 白屈菜红碱HPLC色谱图

2.2 供试品溶液制备

取适量飞龙掌血药材粉碎(过3号筛)称取约0.2 g,精密称定,加50 mL 的50%乙醇超声1.5 h,滤过,取续滤液,即得。

2.3 对照品溶液制备

取白屈菜红碱对照品2.22 mg,精密称定,加50%乙醇定容至100 ml,得22.2µg·mL-1的对照品溶液。

3 结果与分析

3.1 方法学考察

3.1.1 精密度试验

取同批次样品,按2.2 项下供试品溶液制备方法制备供试品溶液,连续进样6次,得到指纹图谱。将白屈菜红碱色谱峰作为参照峰,计算其他各共有峰的相对峰面积和相对保留时间。各共有峰的相对保留时间和相对峰面积分别为0%-0.13%,0%-1.72%,结果表明,仪器精密度良好。

3.1.2 重现性试验

取同批次样品,分别称取6 份,按2.2 项下供试品溶液制备方法制备6份供试品溶液,依次进样,得到指纹图谱。以白屈菜红碱色谱峰为参照峰,计算其他各共有峰的相对峰面积和相对保留时间。各共有峰的相对保留时间和相对峰面积分别为0%-1.34%,0%-1.61%,结果表明,重现性良好。

3.1.3 稳定性试验

取同批样品,按2.2 项下供试品溶液制备方法制成供试品溶液,分别在0 h,3 h,6 h,9 h,12 h,24 h时进样,得到指纹图谱。以白屈菜红碱色谱峰为参照峰,计算其他各共有峰的相对峰面积和相对保留时间。各共有峰的相对保留时间和相对峰面积分别为0%-0.20%,0%-1.92%,结果表明,稳定性良好。

3.2 指纹图谱建立

3.2.1 共有峰的标定

将30 批不同药用部位的飞龙掌血药材,按2.2 项下供试品溶液制备方法制备供试品溶液,测定。按照2.1项色谱条件测定,将色图谱导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统(国家药典委员会,2012 年A 版),得到各部位指纹图谱叠加图谱,以白屈菜红碱色谱峰为参照峰,各自标定了14、15、15 个色谱峰为共有色谱峰,详见图1、2、3、4;相对峰面积详见表2、3、4。

3.2.2 相似度计算根据色谱结果

将不同部位的飞龙掌血药材分别使用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(药典委员会2012 版)进行数据分析,实验结果显示飞龙掌血叶、根皮、茎皮的相似度分别大于0.997,0.966,0.934,表明生成的共有模式图具有代表性(表2)。

3.2.3 药材不同部位HPLC指纹图谱对照图谱比较

本实验分别对飞龙掌血叶、根皮、茎皮的HPLC 指纹图谱进行了对比研究。实验结果发现叶与茎皮和根皮指纹图谱差异明显,茎皮与根皮之间无明显差异,见图5、6、7、8。

4 讨论

4.1 色谱条件的确定

本实验考察了甲醇-水系统、乙腈-水系统[21,24],在2.1 项下的流动相条件及梯度洗脱条件下获得的色谱峰峰型好,基线平稳,分离度良好,色谱峰信息丰富;分别比较了254 nm,269 nm,320 nm,330 nm 的检测波长下的色谱图,发现在320 nm 处检测的峰数目较多,指纹图谱整体特征较好,故选择320 nm 处进行检测;分别对不同柱温(21℃,28℃,35℃)下的色谱图比较,发现随着柱温的升高,色谱信息并无较大变化,选择柱温为28℃。确定为2.1项下的色谱条件。

图2 10批叶HPLC指纹图谱

图3 10批根皮HPLC指纹图谱

表3 飞龙掌血根皮指纹图谱共有峰相对峰面积

表4 飞龙掌血茎皮指纹图谱共有峰相对峰面积

4.2 供试品溶液制备方法的确定

图5 飞龙掌血HPLC对照指纹图谱

表5 相似度评价结果

图6 叶与根皮对照指纹图谱对比图

图7 叶与茎皮对照指纹图谱对比图

图8 茎皮与根皮对照指纹图谱对比图

分别比较甲醇、不同体积分数的乙醇为溶剂提取样品后,所获得的高效液相色谱指纹图谱,结果采用50%的乙醇提取所得样品的色谱峰的峰数较多,峰型较好,指纹图谱整体特征表现的较好。采用超声提取法操作简便、快速。确定为2.2项下的提取条件。

4.3 飞龙掌血相同部位的化学成分分析

本研究分别对飞龙掌血根皮、茎皮和叶进行指纹图谱分析研究。研究发现三者的指纹图谱相似度较高,不同批次的相同部位的药材具有高度相似性,其质量可控。但不同批次药材的峰面积有着明显差异,RSD 最高可达66.72%,表明药材的内在相关活性物质的含量存在明显差别。其中叶的差异相对较低,RSD 在21%-37%之间,其原因可能是不同批次药材叶中含有老叶和嫩叶的比例不同。根皮和茎皮的含量差异较大,RSD 在27%-67%之间,其原因可能与药材的树龄,采收时间和地点相关。通过上述对比分析,发现不同产地可能是导致含量差异明显的重要因素。

4.4 飞龙掌血不同药用部位HPLC 指纹图谱对比分析

4.4.1 茎皮与根皮对比分析

课题前期[24]对茎皮与根皮色谱指纹图谱研究发现两者具有一定相似性,但未对叶进行分析,色谱峰较集中。本研究对前期色谱条件进行调整,首次建立了飞龙掌血叶、茎皮和根皮三者的指纹图谱,并对三者进行对比分析。该飞龙掌血指纹图谱方法不仅共有峰数量较多,且各色谱峰间分离度较好。其中,根皮、茎皮均有15 个共有峰,且各共有峰保留时间基本一致,两者色谱峰的整体面貌接近。结果表明,飞龙掌血根皮与茎皮化学组成相近,与课题组前期研究[24]相符,为飞龙掌血茎皮作为根皮的使用提供一定理论依据。对提高飞龙掌血利用率,促进野生资源的合理利用具有重要意义。

4.4.2 叶与茎皮和根皮对比分析

通过对叶与茎皮和根皮的对照指纹图谱比对分析,发现叶、茎皮、根皮分别有14、15、15 个共有色谱峰。叶与茎皮和根皮色谱图差异明显,特别是在以白屈菜红碱为有效成分的生物碱部位共有色谱峰个数减少明显,由图6、7可知,其减少的色谱峰包括a、b、c、d、e、f、g、h、i、j 在内的共计10 个共有色谱峰。表明飞龙掌血中以生物碱为主体的活性成分主要富集在根皮、茎皮部,叶部相对较少。但叶色谱图中共有峰较茎皮,根皮也存在新增,主要体现在药材叶的色谱图中的2、3、4、6、8、10、11、13、14 号在内的共计9 个共有色谱峰。表明飞龙掌血叶中也存在部分根皮、茎皮中没有的活性成分,同时叶的色谱图中前段色谱峰较根皮、茎皮明显增多,表明药材中一些极性较大的化学成分主要富集在叶部,根皮、茎皮部相对较少。

有文献研究[21-24]飞龙掌血的指纹图谱,但对叶、根皮、茎皮三者的指纹谱图相似性对比研究却无报道。本研究最终发现飞龙掌血叶与根皮和茎皮的化学成分差异明显,而根皮与茎皮的化学成分相似。贵州省中药材的地方标准中分别将飞龙掌血叶和根皮作为药用部位入册,其功能主治有不同,是可行且准确的。本研究也表明飞龙掌血叶和根皮具有显著差异,为此标准将两者分开入药提供理论依据。同时,本研究结果进一步从理论数据上为飞龙掌血茎皮替代根皮的使用提供支撑。从而对提高飞龙掌血的利用率,促进中药野生资源的合理利用有着非常重要的意义。

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