Robo4敲除促进大鼠缺血心肌微血管生成

周蓉芳 毛建华 寿晓玲 王雁 王伯忠

[摘要]目的探讨Robo4敲除对大鼠急性心肌梗死后缺血心肌微血管生成的影响。

方法采用结扎左冠状动脉主干方法复制大鼠急性心肌梗死模型，分为Robo4敲除大鼠假手术组（Robo4 sham）、SD大鼠假手术组（SD sham）、Robo4敲除大鼠心肌梗死组（Robo4 MI）和SD大鼠心肌梗死组（SD MI）。14天后提取大鼠MI边缘区心肌组织，VWF8免疫组织化学染色，检测微血管生成密度（MVD）。结果两假手术组间MI边缘区MVD无明显变化[（2.27±0.53）个比（1.89±0.34）个，P>0.05]。与SD sham组相比，SD MI组MI边缘区MVD显著增加[（16.63±3.13）个比（1.89±0.34）个，P<0.01]。与SD MI组相比，Robo4 MI组MI边缘区MVD显著增加[（22.49±3.05）个比（16.63±3.13）个，P<0.05]。结论大鼠急性心肌梗死14天后缺血心肌微血管生成增加，且Robo4敲除可以促进缺血心肌微血管生成。

[关键词]Robo4;急性心肌梗死;微血管生成

中图分类号：R361;R542

文献标识码：A文章编号：1009-816X（2019）01-0061-03

治疗性血管生成，又称“自身冠状动脉搭桥”，能减轻心肌缺血坏死，预防和延缓缺血性心脏病和室壁瘤的形成，改善临床症状和预后，已逐渐成为急性心肌梗死研究的热点。神经迁移蛋白Slit2和其受体Robo4是近年来发现的在血管系统中起着关键调节作用的信号途径，一方面能抑制促血管生成因子导致的新生血管簇状生长;另一方面改善内皮细胞通透性，从而维持完整血管网的屏障功能[1]。目前对于Slit2-Robo4信号途径的研究主要集中在上调该信号途径用于抑制病理性血管生成，而对于下调该信号途径在治疗性血管生成方面研究不多，尤其是在心肌梗死后缺血心肌中的作用尚不清楚。本研究旨在体内动物模型中观察心肌梗死后大鼠心功能的变化，探讨Robo4敲除对大鼠心肌梗死14天后缺血心肌微血管生成的影响。

1材料与方法

1.1实验动物和试剂：Sprague-Dawley（SD）大鼠委托广东赛业有限公司培育Robo4敲除转基因大鼠，并委托浙江省实验动物中心进行繁殖，取P2代15只，SD大鼠15只，SPF级，雄性，2月龄，体重约200～250g，均由浙江省实验动物中心提供。水合氯醛购自国药集团化学试剂有限公司;Robo4一抗，购自美国abcam;VWF8一抗及免疫组化检测试剂盒EnVisionTM Two-Step，購自丹麦DAKO;山羊抗兔二抗，购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2实验方法：15只Robo4敲除转基因大鼠采用随机数字表法分为两组，即：Robo4敲除大鼠假手术（Robo4 sham）组（5只）和Robo4敲除大鼠心肌梗死（Robo4 MI）组（10只）。15只SD大鼠采用随机数字表法分为两组，即：SD大鼠假手术（SD sham）组（5只）和SD大鼠心肌梗死（SD MI）组（10只）。所有大鼠术前12h禁食不禁水。10%水合氯醛3ml/kg腹腔麻醉，仰卧位固定，胸部皮肤去毛，碘伏消毒。肢体Ⅱ导联监测ECG。口鼻部戴自制呼吸面罩，连接呼吸机维持呼气末正压呼吸（呼吸机参数设置为：呼吸频率55～60次/分，呼吸比为1：2，潮气量为20mL/kg）。以左心耳与肺动脉圆锥之间心大静脉为标志，左心耳下缘2～3mm处进针，肺动脉圆锥侧出针，进针深度1.5～2mm，宽度2～3mm，结扎左冠状动脉主干。肉眼观察左心室壁变白，ECG QRS波形变高变宽，S波与T波交点（J点）明显抬高，或者出现R波消失，呈典型QS波形时，提示结扎成功。关胸，逐层缝合肌肉与皮肤。关胸前留置静脉留置针用于抽出胸腔空气恢复负压。术后3天肌注10万单位青霉素钠抗感染。假手术组除结扎外，其余同手术组。模型复制后14d取左心室缺血区冠状位分为2部分，一部分4%多聚甲醛固定做免疫组织化学染色;一部分液氮急冻后转-80℃冰箱保存用于Western blotting检测。提取心肌梗死边界处心肌组织总蛋白，Bradford法测定蛋白浓度，取20ug蛋白，100摄氏度加热变性5min。Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，封闭，一抗（Robo4）孵育4℃过夜，辣根过氧化物酶标记的二抗孵育1h，洗膜，ECL显色系统感光显影，定量各蛋白条带的总灰度值。4%多聚甲醛固定12h后，将心肌组织平均分为3段，石蜡包埋在同一平面上，4μm切片。常规脱蜡、水化，高温高压抗原修复，阻断内源性过氧化物酶10min，VWF8一抗37℃孵育60min，磷酸缓冲盐溶液（PBS）冲洗3次，二抗37℃孵育30min，PBS冲洗3次，氨基联苯胺（DAB）显色，苏木素复染，每张切片选择心肌梗死边界处，200倍显微镜下每组选取10个视野，视野大小为351.1726um×468.5357um，计数VWF8标记阳性的微血管数目。

1.3统计学处理：采用SPSS 21.0软件进行统计学分析，数据以（x-±s）表示，两组间比较采用独立样本t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1Robo4敲除转基因大鼠鉴定：复制急性心肌梗死模型14天后，提取心肌梗死边界处心肌组织，免疫印迹法检测Robo4表达变化（见图1）。在正常心肌组织中，Robo4处于低表达状态。与SD sham组相比，SD MI组Robo4表达显著增高（t=6.89，P=0.01）。与SD MI组相比，Robo4 MI组表达显著下调（t=3.90，P=0.02）。

2.2Robo4敲除促进缺血心肌微血管生成：复制急性心肌梗死模型14天后，取左心室组织VWF8免疫组织化学染色检测心肌梗死边缘区微血管密度（MVD）（见图2）。Robo4 sham组与SD sham组相仿，仅有少量微血管生成[（2.27±0.53）个比（1.89±0.34）个，P>0.05]。但与SD sham组比较，SD MI组心肌梗死边缘区可见较多的微血管腔形成[（16.63±3.13）个比（1.89±0.34）个，t=10.49，P<0.01]，说明心肌梗死后大鼠缺血心肌微血管生成活化。与SD MI组比较，Robo4 MI组心肌梗死边缘区微血管腔显著增多[（22.49±3.05）个比（16.63±3.13）个，t=3.00，P=0.02]，说明Robo4敲除能促进该病理情况下的微血管生成。