食管癌干细胞的分离、培养及鉴定

杨 婷， 马 磊， 蔡少青， 梁宏开

(1中山市人民医院重症医学科， 广东 中山 528403； 2佛山市南海区第八人民医院外一科， 广东 佛山 528216)

食管癌是源于食管鳞状上皮的恶性肿瘤，进行性吞咽困难为其最典型的临床症状，全世界每年有超过40万例死于食管癌[1]。目前，手术仍是治疗食管癌的主要方式，但根治性手术后40%～50% 患者会出现复发和转移，高复发、转移风险是影响患者生存的主要因素[2]。与其他消化道恶性肿瘤相比，食管癌的辅助治疗效果及5年生存率均较差，其治疗领域还有许多问题有待解决；其中，食管癌发病原因不清是其治疗难度大的重要原因之一[3]。继1997年Bonnet等首先从白血病患者血液中成功分离出肿瘤干细胞以来，许多学者提出了肿瘤干细胞假说[4-5]，已有研究人员成功从乳腺癌、 脑肿瘤和结直肠癌等[6-8]实体肿瘤中分离并鉴定出肿瘤干细胞。食管癌是否也存在肿瘤干细胞，其发生、发展和转移是否与肿瘤干细胞相关,这些问题需要进一步研究。研究肿瘤干细胞最大的难题在于其数目稀少，研究者难以获得大量的实验原材料用于深入的研究。本实验拟采用无血清培养法从食管癌细胞株Eca109中培养、分离肿瘤干细胞，并尝试对其进行克隆繁殖，目的是为进一步研究食管癌肿瘤干细胞提供充足的原材料。

1 材料与方法

1.1细胞培养人食管鳞癌细胞株Eca109 购于中国科学院上海细胞生物研究所细胞库。在含10%胎牛血清的达尔伯克改良伊格尔F12养分混合(DMEM/F12)培养液(pH 7.2)中，置于37℃、5% CO2孵箱中培养，每2～3天消化、传代。待细胞进入对数生长期后逐步降低培养液中的血清含量，并于培养液中添加胰岛素、表皮生长因子和转铁蛋白等元素，直至完全的无血清培养。

1.2实验方法

1.2.1 细胞周期检测 胰酶消化、收集Eca109细胞，离心4 min待用；用70 μmol/L的滤网收集球样细胞，离心、清洗后用胰酶消化成单个细胞待用。将上述2种细胞清洗后均匀打散，加入事先预冷的1.5 mL 70% 乙醇中吹打混匀，4℃冰箱内固定2 h，取出后用PBS液清洗、重悬后加入0.25 mL PI(200 μg/mL) ，混匀后将上述混悬液稀释4倍，再加入1 μL Rnase A(100 μg/mL)，置于室温，避光60 min，过400目尼龙网后用流式细胞仪进行细胞周期检测。

1.2.2 肿瘤干细胞标记物的检测 将Eca109细胞及球样细胞消化制成单细胞悬液后接种到6孔板中(板内事先放置1张盖玻片)，37℃、5% CO2孵箱中培养3 d后取出盖玻片，福尔马林(4%)固定10 min，Triton X-100(0.1%)透化5 min，山羊血清(10%)封闭，滴加干细胞特异性抗体Lgr5，将玻片置于湿盒内，4℃冰箱过夜，然后在玻片上滴加荧光素标记抗体(1∶150)，室温放置60 min，4’,6-联脒-2-苯基吲哚*盐酸盐(DAPI)染色、磷酸缓冲盐溶液(PBS)清洗，封片后避光保存，激光共聚焦显微镜观察。

1.2.3 裸小鼠体内致瘤实验 实验动物为NOD/SCID小鼠 12只，4～6 周龄，SPF级，购于中山大学动物实验中心。将Eca109细胞及球样细胞消化成单个细胞，调至实验需要的浓度。将NOD/SCID小鼠随机分为 6 组，每组2只，依次于双侧后腿处皮下注射2×103、 2×104和 2×105个Eca109细胞和球样细胞，观察成瘤情况，4周后处死动物，取出皮下瘤体进行称重、测量。肿瘤体积计算方法：长(mm)×宽(mm)×高(mm)π/6。

2 结果

2.1球样细胞的培养Eca109细胞逐步过渡到无血清培养液中培养约7 d后，即可在上清液中得到悬浮的球样细胞，过滤、收集球样细胞进行消化、传代，可获取大量球样细胞。镜下观察悬浮生长的球样细胞，可见球样细胞是由诸多单个的球形细胞聚集而成的细胞团块，结构致密，大小不均。构成球样细胞的单个球形细胞大小形态均匀，细胞核大(图1)。

a： Eca109细胞于含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液中培养72 h (×40倍) b: Eca109细胞于无血清培养液中培养7 d后生成的球样细胞 (×40倍) c: 球样细胞有无数个单个球形细胞构成(×200倍)

2.2细胞周期分析结果用流式细胞仪检测Eca109细胞及球样细胞的细胞周期：(47.88±6.34)%的Eca109细胞有处于合成期及有丝分裂期即(S期+G2/M期)，(52.12±4.53)%处于分裂前期即静止期即(G0/G1期)；(16.81±2.35)%的球样细胞处于S期+G2/M期，(83.19±4.52)%处于G0/G1期，两者比较差异有统计学(P<0.05，表1、图2)。说明大多数球样细胞处于静止期，具备肿瘤干细胞特性。

表1 Eca109贴壁细胞及球样细胞的细胞周期

a: 球形细胞的细胞周期分布(%) b: Eca109细胞的细胞周期分布(%)

2.3肿瘤干细胞标记物表达情况用激光共聚焦显微镜观察肿瘤干细胞标记物含亮氨酸丰富重复G蛋白偶联受体5重组蛋白(Lgr5)在Eca109细胞和球样细胞的表达情况，100倍镜头下至少观察5个视野，计数荧光染色呈阳性的细胞个数，结果提示，Eca109细胞中此标记物的表达率为(22.67±3.62)%，而球样细胞中这个标记物的表达率均为100%，差异有统计学意义(P<0.05)。说明球样细胞表达干细胞标记物的能力更强，具备肿瘤干细胞特性(图3)。

2.4体内成瘤能力实验将Eca109细胞和球样细胞接种于NOD/SCID裸小鼠双侧后腿皮下4周后观察到：接种2×103、2×104和2×105个Eca109贴壁细胞的裸小鼠皮下均未成瘤；接种2×103个球样细胞的裸小鼠皮下未成瘤，接种2×104个球样细胞的裸鼠有1侧成瘤(1/4)，肿瘤体积为76.88 mm3；接种2×105个球样细胞的裸小鼠有2侧成瘤(2/4)，肿瘤体积为(175±22.79)mm3；接种2×106个球样细胞的裸鼠4侧均成瘤(4/4)，肿瘤体积为(222.37±18.52)mm3。Eca109贴壁细胞和球样细胞的体内成瘤实验结果差异明显(P<0.05)，且随着接种球样细胞的数目增多，瘤体的体积有增大趋势,说明球样细胞在裸鼠体内的成瘤能力更强，具备肿瘤干细胞特性(图4)。

球状细胞

Eca109细胞

a: 接种2×105个球样细胞 b: 接种2×106个Eca109细胞 c: 接种2×104个球样细胞 d: 接种2×106个球样细胞

3 讨论

肿瘤干细胞概念的提出为探索恶性肿瘤的发生机制和靶向治疗开辟了一条新的研究途径。肿瘤干细胞是指具有自我更新及产生组成肿瘤不同细胞能力的肿瘤细胞亚群，这些细胞显示出干细胞样特性与持续维持致瘤的能力。越来越多的证据表明，肿瘤干细胞是肿瘤发生、转移和复发的根源，已成为治疗肿瘤的新靶点[4-5]。食管癌是一种鳞状上皮来源的恶性肿瘤，目前针对食管癌的治疗方法主要是手术及术后辅助放疗。然而，虽同为消化道恶性肿瘤，食管癌的治疗效果及5年生存率均较胃癌和肠癌差，其治疗领域还有许多问题有待解决，其中一个重要问题可能是食管癌中存在为数很少的肿瘤干细胞，发挥着启动和维持肿瘤生长及复发的作用[9]。然而，肿瘤干细胞数量稀少，分离获取困难，是阻碍肿瘤干细胞研究的第一个关隘；想要深入研究肿瘤干细胞，首先要解决的问题便是如何能得到大量的肿瘤干细胞。近年来，本课题组在肿瘤干细胞方面研究也取得了一些颇有成效的进展[10]。本实验在以往研究的基础上，探索食管癌中肿瘤干细胞的获取方法，为接下来进一步研究食管癌的发生、发展和治疗奠定基础。

与其他类型的干细胞，如胚胎干细胞、神经干细胞一样，自我更新、无限增殖和分化潜能也是肿瘤干细胞的特征[11]。本研究运用无血清培养法培养出的球样细胞可以在体外繁殖和传代，传代后的球样细胞生长方式和性状稳定，符合干细胞自我更新和无限增殖的特点，很可能是源于食管癌的肿瘤干细胞。

细胞的生长周期分为生长前期(G0/G1期)、合成期(S期)及有丝分裂期(G2/M期)，分裂旺盛的细胞如恶性肿瘤细胞、皮肤细胞、肝脏细胞等较多处于S期和G2/M期，而各种干细胞包括肿瘤干细胞在则常处于细胞周期中的静止期即生长前期(G0/G1期)[12]。本研究通过流式细胞仪检测Eca109细胞和球样细胞周期，结果发现球样细胞中处于静止期的细胞数远远多于贴壁细胞。这一结果表明，经过无血清培养后的Eca109球样细胞与贴壁细胞相比，特性发生了巨大变化，分裂期细胞减少，静止期细胞增多；从细胞周期分布的角度而言，这是干细胞的特性，说明本研究培养出的球样细胞可能是源于食管癌的肿瘤干细胞。

Lgr5是G蛋白偶联受体家族的成员之一，多个研究表明Lgr5是多种组织成体干细胞的标志物，并与肿瘤的形成密切相关[13]。在对食管癌的研究中发现，Lgr5的高表达率与食管腺癌不良预后独立相关，提示Lgr5有作为Barrett食管、不典型增生和食管腺癌生物学标记的潜能，是癌前病变及肿瘤的潜在生物学标记物[14]。本实验运用免疫荧光技术鉴定了Lgr5在Eca109细胞和球样细胞中的表达情况，发现球样细胞表达此标记物的比率远远高于Eca109细胞，说明相较Eca109细胞，球样细胞更多地表达干细胞标记物，显现出干细胞特性，可能是源于食管癌的肿瘤干细胞。

能够在裸鼠体内成瘤是鉴定肿瘤干细胞的金标准[15]，本研究将Eca109细胞和球样细胞分别接种在裸小鼠皮下后可观察到Eca109贴壁细胞无法成瘤；而球样细胞成瘤能力较强，2×104个球样细胞即可成瘤，且随着接种细胞数目的增多，移植瘤的体积也增大，体内高成瘤性是肿瘤干细胞特有的能力，提示通过无血清驯化培养后的球样细胞是肿瘤干细胞。

综上，本研究采用逐步降低培养液中胎牛血清浓度直至无血清的方法，对食管癌细胞株Eca109进行了驯化培养，成功分离出悬浮于培养液中生长的球样细胞，将该球样细胞收集后进行传代，获取大量球样细胞，后采细胞周期分析、干细胞标记物检测及裸小鼠体内成瘤等方法鉴定了该球样细胞的干细胞特性，证实球样细胞处于细胞周期中的静止期、高表达干细胞标记物和具有体内致瘤能力，证明本研究培养出的球样细胞源于Eca109的食管癌干细胞。