柑橘黄龙病菌PCR阳性病株空间分布格局与参数特征应用研究

孟幼青，汪恩国，李艳敏，明 珂，袁亦文

(1.浙江省植物保护检疫局，浙江 杭州310020； 2.临海市农技推广中心，浙江 临海317000； 3.台州市植物保护检疫站，浙江 椒江318000； 4.温州市农业局，浙江 温州325000)

柑橘黄龙病(Huanglongbing，HLB)是由一种韧皮部杆菌属(CandidatusLiberibacter spp.)细菌引起的，目前广泛分布在亚洲、非洲、美洲等近50个国家和地区，对柑橘产业具有毁灭性危害，自然条件下主要通过携带病菌的柑橘木虱取食传播，其症状表现较为复杂多样[1-4]。田间目测调查常常产生误诊和漏诊现象，同时由于柑橘植株从感病到显症具有较长潜伏期[4]，无法涉及田间潜伏隐症病株，依“红鼻果”测定柑橘黄龙病空间分布信息也常存较大误差，PCR分子检测可有效解决田间误诊和隐症病株遗漏问题，目前应用柑橘黄龙病菌PCR分子技术开展果园病株空间分布型和抽样技术的研究尚属鲜见[5-11]。为了更全面、更准确地揭示浙江柑橘黄龙病阳性病株空间分布格局及其参数特征，建立柑橘黄龙病理论抽样数模型和序贯抽样模型，规范田间监测预警与抽样技术，笔者于2017—2018年对浙江7个柑橘黄龙病发生区的橘树逐株采样2 900个进行黄龙病菌PCR检测，系统调查研究柑橘黄龙病阳性病株空间分布格局与参数特征，旨在明确黄龙病阳性病株田间分布信息及其染病特征，探讨病害发生与流行原因，为柑橘黄龙病监测防控和相关试验研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 调查采样地概况

调查选自2000年浙江柑橘黄龙病入侵扩散危害的发生区域，即位于浙东南沿海和浙西南的瓯海、乐清、玉环、黄岩、宁海、庆元和莲都等7个县(市、区)的样地橘园，调查柑橘品种为瓯柑、椪柑、温州蜜柑、本地早、玉环柚、甜橘柚等，果园树龄15～20年，种植密度675～1 200 株·hm-2，果园立地平原和山地，栽培常规管理，部分橘园失管。

1.2 调查采样方法

2017年12月至2018年1月，根据调查县(市、区)柑橘种植情况和柑橘黄龙病发生情况，每县(市、区)选定柑橘果园面积33 hm2左右作为1个调查样地，每样地选择4～5个连片果园，每果园调查100株，先逐株采用目测调查斑驳黄化、新梢均匀黄化、黄脉和缺素黄化等显症疑似病株[12]，然后1株采1样，按树冠东南西北中5方位采集当年抽生的春梢叶片(有以上症状的则取其症状叶)各1张，5张组合为1样，并依序进行采样编号，然后室内测定柑橘黄龙病菌阳性或阴性。

1.3 黄龙病菌PCR检测

委托浙江省检验检疫科学技术研究院，采用GBT28062—2011柑橘黄龙病菌实时荧光PCR检测方法，对采集样品进行柑橘黄龙病菌携带情况检测，记录PCR检测鉴定结果，然后依序按10株1样方，统计田间阳性病株发生频次。

1.4 数据处理及分析方法

2 结果与分析

2.1 柑橘黄龙病PCR阳性密度频次分布

2.2 柑橘黄龙病PCR阳性病株空间分布型

2.2.1 聚集度指标测定

应用聚集度指标测定结果显示，被测7个橘区(橘园)样地的黄龙病PCR阳性病株空间分布均达到C>1、I>0、K>0、CA>0、M*/m>1，均为聚集分布格局(表2)。表明柑橘黄龙病阳性病株的空间分布型为聚集分布格局，其聚集强度随阳性病株密度升高而增强。

2.2.2 Iwao法检验

表1柑橘黄龙病PCR阳性病株密度及其频次分布表

Table1Density and frequency distribution of Citrus Huanglongbing PCR-positive plants

样地序号(橘区)Sample SerialNumber(Affected area)抽样检测样方数Quadratenumber柑橘黄龙病PCR阳性病株频次分布统计数量Statistical frequency distribution of Citrus Huanglongbing PCR-positive plants012345678910阳性数量Number ofpositiveplants阳性率Positiverate/%阳性密度均值Averagepositivedensity(x)1(瓯海 Ouhai)402533321011015614.001.40002(乐清 Yueqing)401873221120229022.502.25003(玉环 Yuhuan)401665523111007518.751.87504(黄岩 Huangyan)501637920210007114.201.42005(宁海 Ninghai)4037201000000051.250.12506(庆元 Qingyuan)40333400000000112.750.27507(莲都 Liandu)40315112000000184.500.4500

表2柑橘黄龙病PCR阳性病株分布聚集度指标测定

Table2Determination of distribution index of Citrus Huanglongbing PCR-positive plants

样地序号(橘区)Sample serialnumber(Producingarea)样方数QuadrateNumber平均数Average(x)方差Variance(V)扩散系数Diffusioncoefficient(C)丛生指数Clumpingindex(I)KCA拥挤度Degree ofcongestion(M∗)M∗/m分布格局Distributionpattern1(瓯海Ouhai)401.40005.8400 4.1714 3.1714 0.4414 2.2653 4.5714 3.2653 聚集Aggregated2(乐清Yueqing)402.25009.6875 4.3056 3.3056 0.6807 1.4691 5.5556 2.4691 聚集Aggregated3(玉环Yuhuan)401.87504.6594 2.4850 1.4850 1.2626 0.7920 3.3600 1.7920 聚集Aggregated4(黄岩Huangyan)501.42003.2836 2.3124 1.3124 1.0820 0.9242 2.7324 1.9242 聚集Aggregated5(宁海Ninghai)400.12500.2594 2.0750 1.0750 0.1163 8.6000 1.2000 9.6000 聚集Aggregated6(庆元Qingyuan)400.27500.3994 1.4523 0.4523 0.6080 1.6446 0.7273 2.6446 聚集Aggregated7(莲都Liandu)400.45001.0475 2.3278 1.3278 0.3389 2.9506 1.7778 3.9506 聚集Aggregated

得α=0.697 6，即α﹥0，表明柑橘黄龙病阳性病株田间分布的基本成分是个体群，阳性病株个体间相互吸引，阳性病株在橘区(橘园)中存在明显的发病中心；且β=1.929 6，即β>1，表明阳性病株个体群在橘区(橘园)中呈聚集分布格局，即分布的基本成分个体群之间趋于聚集分布特征，个体群内个体与核心分布相吻合。

2.2.3 Taylor法检验

2.2.4 聚集原因分析

2.3 抽样技术

2.3.1 最适抽样模型

表3柑橘黄龙病PCR阳性病株聚集均数表

Table3Aggregation mean of Citrus Huanglongbing PCR-positive plants

序号No.x2kr(χ2)λ11.42002.165.63723.699122.25001.364.07796.739930.45000.682.60351.728540.12500.230.89330.480151.40000.883.39125.377460.27501.223.64280.823871.87502.536.57834.8844

图1 柑橘黄龙病不同阳性率下所需最适抽样数图Fig.1 Optimum sampling number for different positive rates of Citrus Huanglongbing

当橘区(橘园)黄龙病阳性率5%时，所需允许误差D=0.2的抽样数212株或允许误差D=0.3的抽样数94株；当橘区(橘园)阳性率10%时，所需抽样数D=0.2为129株或D=0.3为57株；当橘区(橘园)阳性率20%时，所需抽样数D=0.2为87株或D=0.3为39株；当橘区(橘园)阳性率30%～50%时，所需抽样数D=0.2为62～73株或D=0.3为28～33株。随着黄龙病阳性病株率的上升，所需抽样数递减。

2.3.2 序贯抽样

表4柑橘黄龙病PCR阳性检测序贯抽样表

Table4Sequential sampling table for PCR positive detection of Citrus Huanglongbing

nD0=0.15D0=0.20D0=0.2530-1885440-101435043479396024269367018464348015660339013957331001295532200954829

2.4 柑橘黄龙病目测诊断与PCR测定病株关系分析

经对上述7个样地果园柑橘黄龙病目测调查病株(E)与PCR阳性病株(Q)关系测定(表5、图2)，总体柑橘黄龙病阳性发病率14.19%，其中阳性病株隐症率1.10%，表明田间柑橘黄龙病的确诊易受病株隐症和目测误诊等干扰影响，目测视症诊断常存病株隐症漏诊情况，且突出表现存在多诊误判现象，通过人为目测诊断与实验PCR测定比较，显示目测诊断病株总体隐症漏诊率7.75%，病株总体累加多诊率47.11%，究其多诊原因主要在于目测视诊以斑驳黄化、缺素黄化、新梢均匀黄化、黄脉等显症症状进行诊断，本次调查3 002株植株目测视症诊断病株743株，其中斑驳黄化症状23.15%、缺素黄化症状59.26%、新梢均匀黄化和黄脉等其他症状17.59%，由于黄龙病缺素黄化症状与栽培生理缺素较易混淆，也易造成误诊。但是，目测诊断病株(率)与实验PCR检测阳性病株(率)两者存在极显著的线性关系，其数学模型为E=1.066 2Q+9.626 4(df=30，r=0.835 8**，r0.01=0.462 9)，依此模型分析目测诊断准确率整体随田间发病率升高而提高，一般田间病株阳性率10%时人为目测诊断准确率仅为PCR阳性检测的50%左右；当田间病株阳性率20%时人为目测诊断准确率可为PCR阳性检测的65%左右；当田间病株阳性率30%时人为目测诊断准确率可为PCR阳性检测的72%左右；当田间病株阳性率50%以上时人为目测诊断准确率可达PCR阳性检测的80%以上。

表5柑橘黄龙病目测诊断病株与PCR检测阳性病株关系表

Table5Relationship between visual diagnosis of Citrus Huanglongbing and PCR-positive strains

样地序号(橘区)Serialnumber果园编号Orchardnumber果园地址Orchardaddress品种Variety树龄Woodage立地条件Siteconditions调查株数Numberof treesinvestigated视症诊断病株Visualdiagnoseddiseased plantsPCR阳性病株PCR-positveplants疑症病株Hypochon-driacplants隐症病株Cryptopathicplants瓯海Ouhai1三垟镇应潭村Yingtan Village,Sanyang Town瓯柑Citrus suavissima Hort. ex Tanaka5平地Flatground100710—32三垟镇应潭村Yingtan Village,Sanyang Town瓯柑Citrus suavissimaHort. ex Tanaka5平地Flatground100505—3丽岙乡曹建村Caojian Village,Liao Township瓯柑Citrus suavissimaHort. ex Tanaka10平地Flatground10048435—4泽雅镇泽雅库区Zeyaku District,Zeya Town瓯柑Citrus suavissimaHort. ex Tanaka血橙Citrus sinensis Osbeckforma sanguinea15山地Mountainousarea10003—3乐清Yueqing5清江镇江沿村Jiangyan Village,Qingjiang Town瓯柑Citrus suavissimaHort. ex Tanaka5山地Mountainousarea1021126—15柚Citrus grandis(L.)Osbeck6清江镇上埠头村Shangbutou Village,Qingjiang Town瓯柑Citrus suavissimaHort. ex Tanaka10平地Flatground1001789—早橘Citrus compressaTanaka

续表5

续表5

图2 柑橘黄龙病人为目测诊断较PCR阳性检测准确程度表Fig.2 Comparison of accuracy of visual diagnosis and PCR-positive detection for Citrus Huanglongbing

3 讨论

田间采样检测结果和检验分析表明，柑橘黄龙病阳性病株空间分布型为聚集分布，其分布的基本成分为个体群，个体间相互吸引，个体群之间趋于聚集分布特征，并且具有密度依赖性，阳性病株密度越高越趋向聚集分布，聚集强度随阳性率上升而增强。究其聚集原因，在于当样方阳性病株密度在0.616 9(阳性率6.17%)以下时，λ<2，聚集是某些如气候条件、栽培管理、病虫防治等影响所致；当样方阳性病株密度在0.616 9(阳性率6.17%)以上时，λ≥2，其聚集是病害本身聚集特性行为与环境条件等综合影响的结果。当前柑橘黄龙病发病流行逐年呈加重趋势，主要原因在于粗放管理果园面积增大，病菌病源扩散，介体木虱种群数量多、带菌率高、传染机率上升，以及气候条件如冬季气温上升促进等影响所致。

由于柑橘黄龙病显症症状多样复杂，本研究所采集的样本症状有斑驳黄化(23.15%)、缺素黄化(59.26%)、新梢均匀黄化和黄脉等(17.59%)显症疑似病株，总体上除斑驳黄化与黄龙病的相关性较高外，其他类型的症状均易产生一定的错误率，视症目测诊断难度较大，因此采集黄龙病相关性较高的样本理论上应该会有较高的检测准确率。通过视症目测诊断(E)与PCR测定(Q)病株比较，两者存在极显著的线性关系，其关系模型为E=1.066 2Q+9.626 4(r=0.835 8**)，由此可见，为了提高病害诊断准确率和田间调查效率，总体应采取实验检测和视症目测相结合，若田间黄龙病发病率为20%以下，则应采取PCR检测诊断调查；若田间黄龙病发病率为30%以上，则可采用视症目测调查。若采用视症目测诊断，一般需在阳性抽样数量基础上增加15%～30%，即可较准确反映阳性病株抽样数量和田间发生情况，这对田间取样监测预警和决策防治具有良好的指导意义。