38个紫薇品种亲缘关系的ISSR分析

乔中全，王晓明， ，李永欣，曾慧杰，蔡 能，刘思思，陈 艺

(1.湖南省林业科学院，湖南 长沙 410004； 2.林木无性系育种湖南省重点实验室，湖南 长沙 410004)

紫薇(LagerstroemiaindicaL.)为千屈菜科(Lythraceae)紫薇属(Lagerstroemia)落叶灌木或小乔木[1]。其花色艳丽、树姿优美，具有花期长、抗污染等优点，深受人们的喜爱，在我国已有1 500多年的栽培历史，全国各地均有种植，是夏季重要观赏树木。

紫薇原产中国，150 a前从亚洲被引种到美国南部，采取杂交育种与选择育种相结合、诱变育种辅以选择育种等手段，开始了国外紫薇属植物的育种研究工作[2]。通过紫薇种内杂交培育出Catawba等6个耐白粉病紫薇品种。引进有抗白粉病特性的屋久岛紫薇(L.faurieiKoehne)，将其与紫薇进行杂交，利用种间杂交先后选育出Miami等20多个抗白粉病紫薇品种[3]。通过化学诱变剂甲磺酸乙酯(EMS)对紫薇种子进行诱变，获得了Dynamite、Red Rocket等8个颜色鲜红、复色花且可持续开花的优良紫薇品种[2]。自1965年至2017年9月底，美国共有94个紫薇品种获得专利，从地域上看，这些品种大多在美国南部和东南部地区选育[4]。

杨彦伶等[5]和张亚东等[6]利用随机扩增多态性DNA标记(RAPD)技术分析了不同花色野生紫薇间的遗传多样性。王献等[7-8]首次完成了紫薇的扩增片段长度多态性(AFLP)银染反应体系，并建立了相关种的AFLP指纹图谱，利用该技术确定了部分紫薇品种间的亲缘关系。顾翠花等[9-10]对紫薇的AFLP技术进行了优化，利用优化后的AFLP分子标记技术分析了福建紫薇、南紫薇及其杂交后代的亲缘关系。徐静静等[11]利用ISSR技术对4个紫薇群体、48个不同花色的紫薇材料进行分析，证实了4个群体的花色遗传多样性。贺丹等[12]对尾叶紫薇和香雪云杂交后代进行表型分析和SSR标记的连锁分析，证明5个表型性状在群体中分布呈连续性，且彼此间呈现相关性。这些研究在紫薇品种鉴定、分类、遗传多样性和评价等方面取得了一定进展，但以往研究多以野生种质或国内品种为研究对象，而对国外引进品种及其相互间亲缘关系研究较少。本研究对来自中国和美国的不同花色、叶色、株型的紫薇品种进行简单重复序列间扩增多态性(ISSR)标记研究，以期深入了解不同来源紫薇品种的亲缘关系。

1 材料与方法

1.1 植物材料

38份供试材料取自湖南省林业科学院试验林场紫薇种质资源圃(表1)。编号1～30为美国引进品种，其中编号1为不育品种，编号19～23叶色紫红色，编号24花复色。编号31～38为国内品种，其中，编号31为抗寒品种，在北京地区可安全过冬，编号32为完全不育品种，这2个品种已通过国家植物新品种审定；编号36为速生紫薇，编号38为矮化品种。

样品采集方法：在选定的植株上随机采集数片嫩叶，用冰袋带回实验室，用双蒸水冲洗干净，保存于-80 ℃冰箱备用。

1.2 基因组DNA提取

采用改良的CTAB法[13](4% CTAB，1.4 mol·L-1NaCl， 0.1 mol·L-1Tris-HCl、pH 8.0，0.02 mol·L-1EDTA、pH 8.0，2% β-巯基乙醇)提取紫薇叶片中的基因组DNA，样品研磨过程中加入2% PVP粉末。使用0.8%琼脂糖凝胶电泳和核酸蛋白测定仪检测DNA的质量和浓度。

1.3 引物筛选与PCR扩增

所用引物参照加拿大哥伦比亚大学(UBC primer set No. 9， University of British Columbia， Canada， http:// www. ubc. ca)公布的植物通用ISSR引物，由生工生物工程(上海)有限公司合成。从100条引物中筛选出扩增条带清晰、多态性好的10条引物(表2)。

PCR反应体系(20 μL)：30 ng DNA模板(1 μL)，1.5 UTaqDNA聚合酶(0.2 μL)，0.60 μmol·L-1引物(1 μL)，0.20 mmol·L-1dNTPs(2 μL)，10×PCR buffer Mg2+free (4 μL)、2.0 mmol·L-1MgCl2(1.4 μL)，ddH2O补足至20 μL。反应程序：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，47～59 ℃退火(不同引物有其特异退火温度)30 s，72 ℃延伸2 min，35个循环；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。1×TAE缓冲液、1.2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR反应引物，使用BIO RAD凝胶成像系统进行拍照记录。所有实验重复3次。

1.4 数据处理与分析

选择清晰度高、重复性好的扩增条带进行分析，把每条带作为1个等位基因，有条带记1，无条带记0[14]，建立原始数据矩阵。使用分析软件NTsys2.10e进行遗传相似性分析和UPGMA聚类分析。用Popgene32计算不同品种间的基因多样性、Shannon信息指数、总体基因多样性等。用NTsys2.10e软件[15]进行遗传相似系数分析。采用Nei-Li相似系数法[16]，计算各个材料间的遗传相似系数I和遗传距离D，I=2mxy·mx-1+my，D=1-I，其中mxy为第x个材料和第y个材料共有的条带数，mx和my分别为第x个材料和第y个材料各自的总扩增带数，并用UPGMA法进行聚类分析。

表1供试材料

Table1Experiment material

代码Code名称Name品种来源Sources品种特性Characteristics1Double Feature美国America花深红色,育性低 Flowers are dark red, low fertility2Bradberry Wine美国America花深紫红色 Flowers are deep red-purple3Catawba美国America 花深紫色 Flowers are deep purple4Siren Red美国 America 花深红色,嫩叶紫红色 Flowers are dark red and young leaves are red-purple5Burgundy Cotton美国 America花白色、略带红色,嫩叶紫红色Flowers are white, slightly reddish and young leaves are red-purple6Red Rooste美国 America 花大红色 Flowers are deep red7Red Filli美国 America 花大红色,嫩叶紫红色 Flowers are deep red and young leaves are red-purple8Rhapsody in Pink美国 America 花浅粉红色,叶片紫色 Flowers are light pink and leaves are purple9Royalty美国 America 花紫色 Flowers are purple10Victor美国 America 花深红色 Flowers are deep red11Centennial Spirit美国 America 花深红色 Flowers are deep red12Violet Filli美国 America 花紫蓝色 Flowers are violet blue13Cherry Dazzle美国 America 花大红色 Flowers are deep red14Berry Dazzle美国 America 花玫红色 Flowers are rose red15Shawberry Dazzle美国 America 花玫红色 Flowers are rose red16Miami美国 America 花粉红色,嫩叶红色 Flowers are pink and young leaves are red17Purple Magic美国 America 花紫色 Flowers are purple18Coral Magic美国 America 花粉红色,嫩叶红色 Flowers are pink and young leaves are red19Best Red美国 America 花大红色,叶片紫红色 Flowers are deep red and leaves are red-purple20Crimson Red美国 America 花大红色,叶片紫红色 Flowers are deep red and leaves are red-purple21Blush美国 America花白色、略带粉红,叶片紫红色Flowers are white, slightly pink and leaves are red-purple22Pure White美国 America 花纯白色,叶片紫红色 Flowers are white and leaves are red-purple23Red Hot美国 America 花大红色,叶片紫红色 Flowers are deep red and leaves are red-purple24Peppermint美国 America 花复色,玫红色略带白边 Flowers are rose red with white edges25Moonlight Magic美国 America 花白色,叶片紫红色 Flowers are white and leaves are red-purple26Midnight Magic美国 America 花粉红色,叶片紫红色 Flowers are pink and leaves are red-purple27Snow White美国 America 花纯白色 Flowers are white28Red Rocket美国 America 花大红色 Flowers are deep red29Dynamite美国 America 花大红色、略带白边 Flowers are deep red with white edges30pink velour美国 America 花深粉红色,嫩叶紫红色 Flowers are deep pink and young leaves are red-purple31晓明1号Xiaoming No. 1 湖南 Hunan 花大红色,嫩叶紫红色 Flowers are deep red, young leaves are red-purple32湘韵 Xiangyun 湖南 Hunan 花粉红色,完全不育 Flowers are pink and complete infertility33紫云 Ziyun 浙江 Zhejiang 花紫红色 Flowers are red-purple34温州红叶Wenzhou Hongye 浙江 Zhejiang 花浅粉红色,嫩叶紫红色 Flowers are light pink and young leaves are red-purple35温江大红Wenjiang Dahong 四川 Sichuan 花深粉红色 Flowers are deep pink36淮南速生Huainan Susheng 江苏 Jiangsu 花浅粉红色,叶片大 Flowers are light pink and leaves are large37淮南红叶Huainan Hongye 江苏 Jiangsu 花浅粉红色,嫩叶红色 Flowers are light pink and young leaves are red38深紫红矮化Deep purple dwarf 浙江 Zhejiang 花深紫红色,矮化品种 Flowers are deep red-purple and plant is dwarf

2 结果与分析

2.1 紫薇叶片基因组DNA提取

琼脂糖凝胶电泳检测结果表明，提取的紫薇叶片基因组DNA浓度高，完整性好，基本无蛋白质和RNA污染。

2.2 PCR扩增产物多态性分析

用筛选出来的10条引物对38个紫薇材料进行PCR扩增，共扩增出81条分子量在200～2 800 bp的条带，其中，多态性条带数量为70条，多态性位点百分率(PPB)为86.42%(表2)，每条引物可以扩增出6～10个DNA条带，平均8.1个。通过PopGen32软件计算出各位点的有效等位基因数(Ne)为1.408 0，Nei’s基因多样性指数(H)为0.249 6，Shonnon’s信息指数(S)为0.386 4。

2.3 品种间亲缘关系

通过PopGen32软件进行样品间遗传相似性系数的计算，得出38个紫薇品种间的Nei’s遗传相似性系数介于0.543 2～0.988 7，平均为0.788 2。淮南速生与淮南红叶之间遗传相似性系数最大(0.988 7)，表明两者亲缘关系比较近。Shawberry Dazzle与温州红叶之间遗传相似性系数最小(0.543 2)，表明两者之间遗传差异较大。

2.4 品种间聚类分析

基于ISSR扩增结果，按UPGMA法分析38个紫薇品种间的遗传关系，得到不同品种间的遗传关系树状图(图1)。在遗传相似性系数0.736处可将38个紫薇品种分为3类群(表3)。

类群Ⅰ均为美国引进品种，在相似性系数0.760处又可分为3个亚类，亚类A为红色系和紫色系品种，包括Double Feature、Royalty、Cherry Dazzle、Violet Filli、Purple Magic、Victor、Berry Dazzle、Shawberry Dazzle、Centennial Spirit、Catawba、Red Rooste，在相似性系数0.858处2个紫色品种(Violet Filli、Purple Magic)和2个玫红色品种(Berry Dazzle、Shawberry Dazzle)分别聚为一类；亚类B包括Siren Red、Burgundy Cotton、Red Filli、Rhapsody in Pink、Miami、Best Red，嫩叶全部为紫红色；亚类C包含2个花色和叶色均不同的紫薇品种(Bradberry Wine、Coral Magic)。

类群Ⅱ包括10个美国引进品种和7个国内培育品种，在相似性系数为0.778处又可分为3个亚类，其中亚类D包括Crimson Red、Red Hot、Blush、Pure White、Dynamite、pink velour、Peppermint、Midnight Magic、Red Rocket等9个美国引进品种和湘韵、晓明1号、深紫红矮化等3个国内培育品种，在相似性系数0.844处3个紫叶品种(Crimson Red、Red Hot、Blush)聚在一起，矮化品种(深紫红矮化)单独聚为一类；亚类E只包含1个纯白色品种(Snow White)；亚类F包含4个花色不同的国内培育品种(紫云、淮南速生、淮南红叶、温江大红)。

表2筛选出的ISSR引物及其扩增结果

Table2Selected ISSR primers and their amplification results

引物编号Primer number引物序列Primer sequence(5’-3’)扩增总条带数Total number of bands amplified多态性条带数Polymorphism bands多态性比率Polymorphism ratio/%UBC814CTCTCTCTCTCTCTCTA66100.00UBC824TCTCTCTCTCTCTCTCG99100.00UBC826ACACACACACACACACC10880.00UBC840GAGAGAGAGAGAGAGAYT10990.00UBC844CTCTCTCTCTCTCTCTRC8562.50UBC845CTCTCTCTCTCTCTCTRG8787.50UBC846CACACACACACACACART7571.43UBC847CACACACACACACACARC99100.00UBC879CTTCACTTCACTTCA7685.71UBC899CATGGTGTTGGTCATTGTTCCA7685.71

表338个紫薇品种的ISSR分类

Table3Classification of 38Lagerstroemiaindicacultivars based on ISSR

类群 Groups品种名 Variety name类群ⅠGroupⅠADouble Feature、Royalty、Cherry Dazzle、Violet Filli、Purple Magic、Victor、Berry Dazzle、Shawberry Dazzle、Centennial Spirit、 Catawba、 Red RoosteBSiren Red、 Burgundy Cotton、 Red Filli、 Rhapsody in Pink、 Miami、Best RedCBradberry Wine 、Coral Magic类群ⅡGroupⅡDCrimson Red、Red Hot、Blush、Pure White、湘韵 Xiangyun、Dynamite、pink velour、晓明1号 Xiaoming No. 1、深紫红矮化Deep purple dwarf、Peppermint、Midnight Magic、Red RocketESnow WhiteF紫云Ziyun、淮南速生Huainan Susheng、淮南红叶Huainan Hongye、温江大红 Wenjiang Dahong类群Ⅲ GroupⅢMoonlight Magic、温州红叶Wenzhou Hongye

图1 基于ISSR标记的38个紫薇品种的UPGMA聚类图Fig.1 UPGMA dendrogram of 38 Lagerstroemia indica cultivars based on ISSR marker

类群Ⅲ包含1个白色引进品种(Moonlight Magic)和1个粉红色国内培育品种(温州红叶)。

3 讨论

从哥伦比亚大学公布的100条植物通用ISSR引物中筛选出的10条引物，能在38个紫薇品种中扩增出清晰、多态性好的条带，共扩增出70个清晰的多态性位点，多态位点百分率为86.42%；每条引物平均可以扩增出8.1个条带，表明ISSR标记可以用于紫薇品种的遗传多样性分析。

聚类分析表明，来自相同地理区域的品种倾向于聚集在一起[17]，来自美国的品种主要分布在类群Ⅰ，而中国栽培品种归入类群Ⅱ，但也存在一些例外品种，如Pure White、湘韵、Dynamite、pink velour、晓明1号，它们来自不同区域却聚在一起。晓明1号是以pink velour为父本，以Dynamite为母本杂交选育出的新品种[18]，因此，可推测这5个品种聚集在一起是因为它们具有相似的遗传背景。

在集群内，存在一些与叶色相对应的子集群，如Siren Red、Burgundy Cotton、Red Filli、Rhapsody in Pink、Miami、Best Red等6个品种的嫩叶均是紫红色；Crimson Red、Red Hot、Blush、Pure White等4个品种的成熟叶均是黑紫色。这些品种除花色不同外，在植株生长习性、植株生活型、植株干皮颜色、花萼特征、花芽形状和花径大小等形态特征上几乎无差异，因此，在形态分类上将它们分为一类，ISSR聚类结果也与此形态分类一致。淮南红叶与淮南速生的遗传相似系数为0.988 7，遗传基础高度一致，但是2个品种间形态差异非常明显，并非同一个品种，可能是因为淮南速生的遗传物质加倍导致，具体原因还需进一步研究。

根据张亚东等[6]、徐静静等[11]的研究结果，L.indica主要按花色聚类，白色聚为一类，紫色聚为一类，但本研究却不能得出相同结论。这可能是由于采样的代表性所致，本研究的实验材料经过了详细的植物学性状调查，除花色外，其他形态特征差异也较大。由此可知，不能仅根据花色来将紫薇品种分类，这与王献等[8]的观点一致。

株型、花萼特征、花色相近的紫薇品种也显示出了一定的亲缘关系，表明这些表型性状可作为紫薇品种分类的关键指标之一[19]。本研究没有扩增出特征谱带，未发现特异的扩增片段与紫薇的株型、花色等相关。另外，紫薇品种的基因型具有高度杂合性，多型性基因位点较多，很难建立基因位点与株型、花色等主要表型性状之间的联系。因此，还需要加大特异性引物的开发，用于深入分析紫薇品种的遗传背景。

我国紫薇种质资源非常丰富，紫薇属植物有18种，但我国紫薇研究工作起步较晚，较美国、日本等国家有一定差距[2]。目前，我国紫薇品种的自主选育、改良能力不足，国内栽培品种主要从国外引进。在引进新品种时，对品种(系)的遗传背景了解甚少，影响后续紫薇选育工作，严重制约了我国紫薇产业的发展。针对这些问题，作者认为今后应加强我国野生紫薇属植物资源的开发力度，积极开展紫薇新品种选育、快繁、栽培和病虫害防治等工作。在引进新品种时应严格区分品种(系)，查清其遗传背景，统一采用拉丁名，不采用商品名。