四川地区养殖锦鲤浮肿病毒检测与系统进化分析

康慧敏，何嘉乐，刘晨恺，周瑶佳，耿 毅，欧阳萍

(四川农业大学 动物医学院，四川 成都 611130)

鲤浮肿病(carp edema virus disease，CEVD)是由鲤浮肿病毒(carp edema virus，CEV)引起的鲤科鱼类死亡的一种病毒性传染病，病鱼的典型症状为糜烂性或出血性皮肤损伤，腮坏死，皮下组织肿胀，凹眼等[1]，病鱼具有明显的反应迟钝、嗜睡等特征，所以又称为鲤鱼睡眠病(koi sleep disease，KSD)[2]。CEV具有很高的特异性，目前的研究发现该病毒仅感染锦鲤和鲤鱼，导致鱼类死亡，幼年鲤鱼死亡率高达60%～100%[3]。鲤浮肿病给全球淡水养殖业带来了巨大的经济损失[4-10]。2015年中国报道鲤浮肿病毒病[11-13]，由于其临床症状与锦鲤疱疹病毒病(koi herpes virus disease，KHVD)相似，在生产中很容易被误诊。鲤水肿病是继锦鲤疱疹病毒病之后，又一个对淡水渔业造成巨大威胁的病毒性传染病。

2017年10月，四川某养鱼场锦鲤暴发一种以嗜睡、腹部肿大、鳃肿胀和眼睛凹陷为临床特征的传染病，发病水温为18～23 ℃，累计死亡率为50%。为研究此次疾病的病因和流行发病规律，将病鱼解剖，通过细菌学和寄生虫检查、病理组织观察、PCR鉴定、电镜观察和系统进化分析，为鲤浮肿病毒的起源进化、分类、疾病诊断和防控提供重要依据。

1 材料与方法

1.1 病料来源

病鱼采自四川省某锦鲤养殖场，濒临死亡锦鲤4条，死亡不久的锦鲤2条，编号为1～6。

1.2 主要试剂

大肠埃希菌DH5α由四川农业大学动物医学院鱼病研究中心实验室保存提供。克隆载体PMD19-T购自美国Invitrogen公司；病毒DNA提取试剂盒、小剂量质粒抽提试剂盒、pMD19-T质粒连接试剂盒、组织DNA提取试剂盒、胶回收试剂盒和2×PCR Master Mix购自美国TaKaRa公司。

1.3 临床症状与组织病理学观察

观察鱼池内患病锦鲤的行为特征，对病鱼样品的鳃、体表、眼、鳍条、肛门等部位进行表观症状观察。解剖病鱼，观察内脏器官的变化，采集鳃和肾脏样品，-20 ℃保存备用。

采集病鱼的鳃、肝脏、脑、脾脏、肾脏等组织样本，10%中性福尔马林固定，常规石蜡切片，苏木精-伊红(HE)染色，中性树胶封片后置于光学显微镜下观察。

1.4 细菌分离与寄生虫检测

无菌条件下，从病鱼肝脏、脾脏和肾脏取样于BHIA平板上划线接种，28 ℃恒温培养24～48 h，观察细菌生长状况。采集病鱼的鳃丝、血液和体表黏液分别进行鳃丝压片、血液和体表黏液涂片观察，在光学显微镜低倍镜下进行寄生虫检测。

1.5 PCR检测

采集病鱼的鳃和肾脏，按照组织DNA提取试剂盒操作说明提取基因组DNA。提取的DNA分别用于检测锦鲤疱疹病毒(koi herpes virus，KHV)、鲤浮肿病毒(carp edema virus，CEV)、鲤春病毒血症病毒(spring viremia of carp virus， SVCV)。根据世界动物卫生组织(OIE)推荐检测KHV的Sph基因进行PCR扩增；参考文献[14]进行CEV引物设计及巢氏PCR反应；参考文献[15]进行SVCV检测，使用引物SVCV_F1和SVCV_R2扩增SVCV糖蛋白基因714 bp的DNA片段后，再用引物SVCV_F1和SVCV_R4经半嵌套式PCR扩增出606 bp的DNA片段。

1.6 电镜观察

取病鱼肾脏于2.5%戊二醛磷酸盐缓冲液保存，用磷酸缓冲液漂洗4 h以上，再用1%锇酸溶液固定，梯度乙醇脱水后，采用环氧树脂包埋剂进行浸透，并于65 ℃中聚合24～58 h。将聚合好的样本超薄切片，在透射电镜下观察[16]。

1.7 CEV P4a基因克隆测序及系统发育分析

PCR产物按照DNA纯化试剂盒操作说明书纯化后，连接到pMD19-T载体上，转化大肠埃希菌DH5α感受态细胞中。培养24 h后，挑取单个菌落进行PCR筛选阳性菌株，提取质粒送上海生物工程有限公司进行序列测定。根据GenBank收录的CEV英国株和波兰株的P4a基因序列，使用DNAstar生物学软件Megalign方法进行序列同源性分析，并通过MEGA6邻接法构建系统进化树进行遗传进化分析。

表1PCR扩增引物

Table1Primers for PCR amplification

引物名称Primer name序列Sequence(5′-3′)长度Length/bpKHV_F1GACACCACATCTGCAAGGAG292KHV_R1GACACATGTTACAATGGTCGCCEV_F1ATGGAGTATCCAAAGTACTTAG528CEV_R1CTCTTCACTATTGTGACTTTGCEV_F2GTTATCAATGAAATTTGTGTATTG478CEV_R2TAGCAAAGTACTACCTCATCCSVCV_F1 TCTTGGAGCCAAATAGCTCARRTC714SVCV_R1AGATGGTATGGACCCCAATACATHCANCAYSVCV_F1 TCTTGGAGCCAAATAGCTCARRTC606SVCV_R4 CTGGGGTTTCCNCCTCAAAGYTGY

2 结果与分析

2.1 临床症状及解剖观察

发病锦鲤主要的临床症状为食欲减退，嗜睡或在池塘边的水面上缓慢、漫无目的游动，遇到惊吓后迅速苏醒，游一段距离后很快陷入沉睡，鱼体出现身体肿胀，体表出现溃烂，眼球、腹部充血，单侧或双侧眼球浑浊，鳃丝肿胀、出血甚至坏死，肝脾肾等器官无明显异常(图1)。

2.2 组织病理学观察

通过组织病理学观察，患病锦鲤鳃小片间上皮细胞大量增生，呼吸上皮出现脱落和坏死，鳃小片的间隙消失发生粘连(图2-A)；肝细胞变性肿胀，部分肝细胞坏死(图2-B)；脑组织可见大量淋巴细胞浸润，神经元细胞变性坏死(图2-C)，可见管套现象和噬神经元现象，脑膜发生增厚和充血，表现为增生性脑膜炎(图2-D)；肾小管上皮细胞肿胀变性，坏死脱落至管腔中，肾间质中有大量巨噬细胞和单核细胞浸润(图2-E)；脾脏病变不明显，有轻微出血现象(图2-F)；心脏和肌肉组织未见明显病理改变。

A，患病锦鲤出现KSD典型症状，如嗜睡，侧身躺着不动；B、C，患病锦鲤身体肿胀(白色箭头为正常锦鲤，黑色箭头所指为患病锦鲤)；D，体表出现溃疡；E，眼睛充血，眼球浑浊；F，鳃丝肿胀。A， The diseased koi had typical symptoms of KSD， such as lethargy， lying on its side; B and C， The body swelling of the diseased koi (the white arrow was normal koi and the black arrow refered to sick koi); D， Ulcers on the body surface; E， Hyperemia of eyes and turbidity of eyeball; F， Branchial swelling.图1 患病锦鲤临床病变Fig.1 Clinical pathological changes of diseased koi carp

2.3 细菌和寄生虫检测

BHIA培养基上培养48 h(28 ℃)上未见菌落生长。鳃丝压片、血液和体表黏液涂片观察均未发现寄生虫。推测患病鲤鱼不是被已知能在BHIA生长的常见致病菌(链球菌、气单胞菌、耶尔森菌、弧菌等)或寄生虫感染而引发死亡。

A，鳃小片发生粘连，细胞增生，呼吸上皮细胞出现脱落和坏死；B，肝脏细胞出现空泡变性和坏死；C，脑组织可见大量淋巴细胞浸润，毛细血管扩张充血；D，脑膜发生增厚和充血；E，肾脏炎性细胞浸润，细胞出现变性和坏死；F，脾脏有轻微出血。A， Adhesion of gill fragments， proliferation of cells， exfoliation and necrosis of respiratory epithelial cells; B， Necrosis and vacuolar degeneration of liver cells; C， A large number of lymphocytes infiltration in the brian tissue， capillary congestion expansion; D， Meningeal thickening and hyperemia; E， Renal inflammatory cell infiltration， cell degeneration and necrosis; F， Slight bleeding in the spleen.图2 患病锦鲤组织病理学观察Fig.2 Histopathological observation of koi infected by CEV

2.4 PCR检测

分别采集1～6组中锦鲤的鳃丝，通过组织DNA提取试剂盒提取组织DNA，进行PCR检测。根据临床症状和流行情况，首先使用OIE推荐的KHV和SVCV引物进行检测，1～6组样品均为阴性。通过巢氏PCR检测方法，进行了CEV检测，第一步PCR反应扩增出528 bp的特异性条带(图3-A)，第二步PCR反应以第一步的PCR产物为模板，扩增出478 bp DNA片段(图3-B)，检测结果为CEV阳性。基因测序结果显示该序列与CEV同源性高达99%，因此可诊断该锦鲤养殖区存在CEV感染。

2.5 电镜观察

透射电镜下观察肾脏超薄切片，在肾脏组织中可见大量痘病毒样病毒颗粒，直径为200～240 nm，有囊膜。病毒大小、形状和结构，符合痘病毒科的特征(图4)。

2.6 序列分析与进化树构建

对巢氏PCR扩增产物(P4a基因)进行测序并分析，将序列上传到GenBank得到的序列号为MG787230。根据P4a基因的部分核苷酸序列，对英国和波兰的19条具有代表性的CEV序列进行了多重比对和系统发育分析。结果表明，本次试验分离到的病毒株与英国株R083和CyPP-3的同源性最高，分别为99%和98%(图5)。通过进化树发现现有CEV毒株主要分为2个基因型。

M，DL1000 marker；1，阴性对照；2～7，第1～6号样品。M， DL 1000 DNA marker; 1， Negative control；2-7， Samples of 1 to 6.图3 CEV巢氏PCR检测结果Fig.3 Nested-PCR detection results of CEV

箭头所示为病毒粒子。The arrow showed viral particles.图4 电子显微镜下的肾组织中的病毒粒子Fig.4 Ultrathin sections of the kidney under the electronic microscope

3 讨论

鲤浮肿病是一种严重危害鲤养殖业的疾病，我国各地均有报道[12-13，16]。2017年10月，四川省某养鱼场锦鲤出现大量死亡，养殖场水温18～23 ℃。基于临床症状、组织病理观察、寄生虫和细菌学检测，排除了致病性细菌和寄生虫感染的可能性，由于KHVD和SVCV都具有相似的临床症状及发病水温[17-18]，同时进行了KHV、SVC、CEV病毒PCR检测。KHV和SVC的PCR检测结果皆为阴性，巢氏PCR方法检测鲤浮肿病毒(CEV)，出现特异性扩增产物，且在肾脏组织中可见大量痘病毒样病毒颗粒，直径200～240 nm，有囊膜，病毒大小、形状和结构符合痘病毒科的特征。基于CEVP4a基因进行系统进化树分析，结果表明本次试验分离到的病毒株与英国株R083同源性最高为99%，证实CEV为引发此次四川地区某养鱼场锦鲤发病的病原。

图5 基于CEV P4a基因序列构建的系统进化树Fig.5 Phylogenetic tree construction based on CEV P4a gene sequence

在患病锦鲤临床症状和组织病理观察中，可见呼吸上皮出现脱落和坏死，鳃和肾脏是主要的病变部位，与国内外的报道相符。温智清等[13]报道，患病锦鲤每250 ng鳃和肾脏组织中CEV病毒载量为250.02～1 332.92，远超其余组织。Ono等[4]报道，鳃是CEV的主要靶器官，皮肤、肝脏、肾脏偶尔也可检测到病毒，患病鲤鱼呼吸上皮严重损伤导致缺氧，患病鲤鱼出现嗜睡症状，表现为侧身浮于水中或在水面上漫游，最终死亡。

CEV特异性很高，主要感染鲤鱼和锦鲤，一般鱼类细胞难以分离到该病毒。在生产中，由于CEVD和KHVD临床症状容易混淆，因此，探究CEV的流行现状、流行株的基因型并进行CEV的诊断和防控具有重要意义。本研究可为CEV进化、分类、疾病诊断和防控提供重要依据。