非洲楝拟茎点霉叶斑病病原菌鉴定及其生物学特性的测定

林 宇，李增平，吴如慧，张 宇

(海南大学 热带农林学院，海口 570228)

非洲楝[Khayasenegalensis(Desr.) A. Juss]又称非洲桃花心木、塞内加楝、塞楝等，是主要的热带速生用材树种,具有重要的经济价值和生态价值。笔者在海南大学海甸校区内调查发现一些非洲楝的叶片发生较严重的叶斑病，通过镜检初步诊断为拟茎点霉属真菌引起的叶斑病，取名为非洲楝拟茎点霉叶斑病。拟茎点霉属(Phomopsis)的有性态为子囊菌门的间座壳属(Diaporthe)，常引起多种植物的叶斑病，也可为害茄子果实引起褐纹病等[1]。非洲楝在我国目前已报道的病害有立枯病(RhizoctoniasolaniKühn)、 炭疽病(Colletotrichumsp. )、叶点霉叶斑病(Phyllostictasp.)、叶枯病(Pestalotiasp. )、叶霉病(Alternariasp.)、无根藤寄生(CassythafiliformisL.)以及褐根病(PhellinusnoxisCorner)等[2],中国真菌志——拟茎点霉属中有楝拟茎点霉[Phomopsisabdita(Sacc.)Traverso]引起的楝树枝枯病的记载[1]。国内外文献中尚未见拟茎点霉属真菌引起非洲楝叶斑病的报道。本研究针对其病原菌进行分离培养、致病性测定、病原鉴定和生物学特性测定，以便为该病害防治提供参考。

1 材料与方法

1.1供试样本非洲楝拟茎点霉叶斑病病叶样本采自海南省海口市海南大学校园内发病的非洲楝病树，将发病的新鲜病叶片样本带回实验室后进行组织分离培养。

1.2供试苗木致病性测定用的苗木为种植于海南大学教学基地内种植1年的非洲楝和大叶桃花心木幼苗。

1.3供试培养基PDA培养基，Czapek培养基，参考方中达[3]《植病研究方法》配制。

1.4菌株分离将采回的新鲜病叶用清水洗净，参照方中达[3]有关叶部病原真菌分离方法，从病健处剪取大小为5 mm×5 mm的病叶组织块，经表面消毒后移到PDA平板上，28 ℃的恒温培养2～3 d后纯化，将纯化菌株编号为FZL01，置于4 ℃冰箱保存备用。

1.5致病性测定参照管斌等[4]的接种方法进行接种。选取无病虫害的待接种植物叶片，先用75%酒精喷雾消毒，待叶片干后，在同一片叶上沿中脉分别用灭菌束针间隔3cm刺出3处伤口，靠叶尖伤口接空白对照、靠叶基的2处伤口接分离菌，重复3次。用灭菌接种环挑取PDA培养基平板培养好的FZL01菌株约1 cm大小的菌丝块覆盖在伤口上，对照接空白PDA培养基，覆盖湿棉花，套上塑料袋进行保湿，第2天去掉塑料袋。定期观察接种叶片的发病情况并做记录。

1.6病原菌鉴定

1.6.1 形态鉴定对病斑上长有小黑点的病叶进行徒手切片，在显微镜下观察30个分生孢子器、50个分生孢子形态特征，测量其大小。参考《植物病原真菌学》[5]《中国真菌志》[1]和中国科学院微生物研究所的“中国微生物与病毒主题数据库”等[6-7]资料进行种类鉴定。

1.6.2 分子鉴定使用 OMEGA Fungal DNA Kit 提取病原菌 DNA。采用通用引物 ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)/ ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)扩增 rDNA基因内转录间隔区以及特异性引物 EF1-728F(5′-CATCGAGAAGTTCGAGAAGG) / EF1-986R (5′-TACTTGAAGGAACCCTTACC)和Bt2a(5′-GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC) /Bt2b(5′-ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC)扩增翻译延伸因子和β-tubulin基因的部分序列。PCR扩增后对其产物进行电泳检测。使用 OMEGA Extraction Kit 试剂盒切胶回收目的片段，纯化后送往生工生物工程(上海)股份有限公司测序。将获得的序列在 NCBI 上进行比对分析，并提交序列，对测序后的 r DNA-ITS 和 EF1-α, β-tubulin序列进行序列联配比较、编辑。利用 MEGA 6.0 软件用邻接法(neighbor-joining，NJ)以Diaporthetoxicodendri,D.vaccinii等为外群，构建系统发育树。

1.7生物学特性测定选长势一致(培养3 d)的FZL01菌株菌落，用灭菌打孔器在其边缘打直径5 mm的圆形菌饼备用，除温度外其他测定条件均在28 ℃恒温培养箱培养，除碳、氮源测定外，其他条件所用培养基均为PDA培养基。采用十字交叉法测量菌落直径。设置条件：(1)在黑暗条件下分别在10，15，20，26，28，30，32，35，40 ℃恒温培养，每处理重复4次；(2)照明灯为25 w，设置3种光暗条件(24 h照明、24h黑暗、照明∶黑暗=12 h∶12 h)，每处理重复4次；(3)将湿热灭菌后PDA培养基的pH值调至2，3，4，5，6，7，8，9，10，11共10个梯度后制平板，接入FZL01菌株菌饼，每处理重复4次；(4)可溶性淀粉、肌醇、蔗糖、甘油、D-山梨醇、甘露醇、α-乳糖、无水葡萄糖、D-果糖、D-半乳糖、D-木糖、D-半乳糖作为Czapek培养基中等质量碳源替换蔗糖，并设置不加蔗糖的Czapek培养基作为对照；(5)牛肉浸膏、大豆蛋白胨、酵母浸膏、硝酸钠、硝酸钾、L-天门冬酰胺、硝酸铵、硫酸铵、氯化铵、草酸铵、 硝酸钙作为Czapek培养基等质量氮源替换硝酸钠，并设置不加硝酸钠的Czapek培养基作为对照。每处理重复4次。

1.8数据分析测量的数据用Excel软件进行数据分析和制表。

2 结果与分析

2.1非洲楝拟茎点霉叶斑病症状病害主要在冬春季发生，从叶尖和叶边缘开始发病，呈现不规则形褐色病斑，病斑边缘具明显的褐色线纹，潮湿条件下外围黑褐色水渍状，病斑向叶基扩展迅速，导致叶片大面积坏死后脱落，在叶正面或背面长出大量散生的黑色小点(分生孢子器)；干燥条件下病斑中央变灰白色，扩展减慢(图1)。

2.2致病性测定接种5 d后发现叶片开始发病，出现浅褐色圆斑，边缘水渍状，14 d后逐渐形成不规则病斑，边缘深褐色，在病斑中央长出黑色小点，为该菌的分生孢子器，对照无明显变化。后期病斑中央部位干枯，部分接种叶片脱落，同一株树上其他叶片无变化，将患病叶片带回实验室进行组织分离，重新分离获得了与FZL01相一致的菌株，表明该菌株为致病菌。

2.3病原菌形态

2.3.1 形态特征FZL01菌株在PDA培养基上28 ℃条件下培养3.5 d后菌丝长满皿，生长较快，菌落白色呈絮状，具有同心轮纹，菌丝较浓密，其背部呈现暗黄色。7 d后观察菌落生长浓密，菌丝表面形成黑色墨汁状粘液，22 d后观察菌落颜色加深呈暗黄色，菌丝聚集形成小黑点，即分生孢子器。病叶上的分生孢子器黑褐色，单个散生，初埋生后突破表皮，扁球形，直径为153.05～243.04 μm(平均195.34 μm)，高103.19～159.51μm(平均132.87 μm)；分生孢子有α、β两型，α型分生孢子无色单胞，纺锤形，大小为(7.8～9.27) μm×(2.54～4.02) μm(平均8.40 μm× 3.49 μm)，多具2个油球；β形分生孢子，无色单胞，线形，一端微弯曲，大小为(13.45～16.63)μm×(1.36～1.93)μm(平均15.24μm×1.61μm)(图2)。其形态特征与拟茎点霉属(Phomopsis)真菌相符[2]。

图1 非洲楝拟茎点霉叶斑病症状

2.3.2 分子鉴定经测序，FZL01菌株的rDNA-ITS、EF1-α和β-tubulin序列分别为543 bp(NCBI登录号为MK050110)、334 bp(NCBI登录号为MK054238)和491 bp(NCBI登录号为MK079660)，分别与Diaporthemusigena序列的相似度为98%(rDNA-ITS，AB899788.1)，92%(EF1-α，KC343869.1)和98%(β-tubulin，KC344111.1)。从Gen Bank中选取含模式菌株在内的相关菌株Diaporthemusigena，D.pascoei，D.arecae等菌株的ITS，EF1-α及β-tubulin序列，使用3种序列联合建树，进行多重序列比较及系统发育学分析，结果显示，该菌株的r DNA-ITS，EF1-α和β-tubulin的联合序列与Diaporthemusigena的同源性达99%，表明该菌株FZL01与Diaporthemusigena的遗传距离最小，聚为一类(图3)。结合形态学特征观察及分子生物学技术鉴定结果，确定引起非洲楝拟茎点霉叶斑病的病原菌为Diaporthemusigena[8]，属子囊菌门(Ascomycota)、核菌纲(Pyrenomycetes)、球壳目(Sphaeriales)、间座壳属(Diaporthe)，其无性态为半知菌类(Imperfect)、腔孢纲(Coclomycetes)、球壳孢目(Sphacropsidales)的拟茎点霉属(Phomopsis)。

2.4生物学特性

2.4.1 温度FZL01菌株在15～35 ℃均能生长，在15～28 ℃是随着温度升高菌落的直径也随着增加，然后逐渐减少，到40 ℃完全停止。菌落在28 ℃长势最好，表明其最适生长温度为28 ℃(图4)。

2.4.2 光照比较3种光照条件下病菌的生长情况，完全光照和完全黑暗条件下长势良好，菌落大小几乎相同，无显著性差异，但与半光半暗长势具显著性差导，表明12 h光暗交替可抑制该菌的菌丝生长(图5)。

2.4.3 pH值在pH为3～10时病菌均能生长，最适病菌生长的是pH值为5，说明在弱酸到中性环境下有利菌丝生长，酸性或碱性过强都会抑制病菌的生长(图6)。

2.4.4 碳源在碳源测定中,以蔗糖为碳源的菌落长势最优，以肌醇、甘露醇、甘油为碳源和未加碳源的菌落都是薄而透明，以糖类为碳源的菌落厚薄均匀长势较好，即病原菌对糖类的利用率优于醇类(表1)。

表1 碳源对菌丝生长的影响

2.4.5 氮源在复合氮源测定中，以大豆蛋白胨为氮源的菌落长势最优；单一氮源中，以硝酸钠为氮源菌落长势最好，但菌落厚薄有差异，有机氮菌落较厚，长势好而硝酸盐菌落较薄，然而硝酸钾厚薄程度与未加氮源的对照菌落相似，近乎透明，表明硝酸盐不易被病菌吸收利用。氮源的利用能力从强到弱依次为：有机氮>铵态氮>硝态氮(表2)。

表2 氮源对菌丝生长的影响

3 讨 论

拟茎点霉属[Phomopsis(Sacc.)Bubak]是半知菌类、腔孢纲、球壳孢目中的一个重要真菌属，在分类上多以有性态间座壳属(Diaporthe) 为属名鉴定种[8]，其种类多、广泛分布于热带和亚热带地区[4]。拟茎点霉属也是植物的一种内生真菌，在自然界的大部分植物体内广泛存在，其代谢产物与植物的一系列生理生化反应都有一定的相关性。近年来随着对拟茎点霉属新种及其病害的不断报道，拟茎点霉属菌物也引起了人们越来越多的重视[5]。到2005年为止报道该属寄主植物共74科[6]。主要有柑橘、西番莲、草莓、杨梅、茄子、天麻、香龙血树、青麻、田旋花以及凤梨科、棕搁科和竹芋科等植物[9]。该属真菌主要侵染植物的叶、枝及果，很少侵染根，且容易从伤口侵入，引起溃疡、烂茎、根腐、果腐、叶枯、枝枯和树皮坏死等症状[10]。例如由油球拟茎点霉[Phomopsisdiplodinoides(Sacc) Punith]和筒凤拟茎点(Phomopsisspectabilis)引起凤梨科植物叶斑病，由棕竹拟茎点霉(Phomopsisrhapidis)引起的棕榈科植物褐斑病[11]。对于拟茎点霉属种的生物学特性研究有很多报道。本研究发现引起非洲楝拟茎点霉叶斑病的病原菌为Diaporthemusigena，光暗交替可抑制该菌的菌丝生长；温度28℃， pH为5，氮源为大豆蛋白胨，碳源为蔗糖时菌丝生长最适，易从伤口侵入。2002 年谢玲等报道广西芒果褐色蒂腐病菌(Phomopsismangiferae)的最适生长温度为25 ℃；适宜生长pH为6.0[12]，2013年张居念等报道福建采后龙眼果腐病菌龙眼拟茎点霉(PhomopsislonganaeChi)的最适生长温度范围为 25 ℃，12 h光暗交替生长最佳，最适的 pH为 6[13]。2011年牛晓庆等报道油棕叶斑病菌拟茎点霉(Phomopsis sp.)的最适生长温度为25 ℃；最适 pH 为7.0[14]； 以葡萄糖为碳源，以蛋白胨为氮源最适合菌丝生长。与本研究的Diaporthemusigena在温度、pH、碳源,都存在不少差异，推测可能为不同地理来源、不同寄主的同一属真菌不同种间会存在较大差异所致[13]。另外，拟茎点霉属真菌较其他种属的真菌而言，可能对干热生态环境有着更强的耐受力和适应力，更容易在宿主植物中生长、传播和蔓延[15]。目前对楝科植物病害的详细研究还比较少，但是楝科植物其潜在经济价值需要对其发生的病虫害等方面进行更详细的研究，以便在其某一种病害发生时可及时有效地进行生产防治。