桃红四物汤中6种指标性成分的含量测定

王继陈，韩 岚，张艳艳，彭代银

(1.安徽中医药大学药学院，安徽 合肥 230012；2.中药复方安徽省重点实验室，安徽 合肥 230012；3.安徽医学高等专科学校，安徽 合肥 230601)

桃红四物汤是活血化瘀、养血调经的经典名方，由桃仁、红花、当归、川芎、熟地黄和白芍组成。现代药理研究表明，桃红四物汤中阿魏酸、羟基红花黄色素A、苦杏仁苷、藁本内酯等成分具有抗炎、抑制血小板聚集、抗血栓形成、抗血小板活化等药理作用[1-3]，临床上可用于治疗脑缺血、骨折、痛经、产后病等疾病[4-7]。对此，建立桃红四物汤质量控制标准十分必要，现行《中华人民共和国药典》(2015年版)中无桃红四物汤的质量控制标准，且目前关于桃红四物汤质量控制的研究较少，对成分的考察较为片面，只选择某一部位或者某一类成分进行考察[8-11]，且忽视中药复方整体性、复杂性的特点，仍然需要进一步研究。本研究采用超高效液相色谱法建立同时测定羟基红花黄色素A、苦杏仁苷、芍药苷、阿魏酸、毛蕊花糖苷、藁本内酯6种成分含量的方法，为桃红四物汤的质量标准研究提供依据。

1 仪器与试药

1.1 主要仪器 1290 Infinity超高效液相色谱仪[包括G4220A 1290 Bin Pump(系列号DEBAA05426)四元泵、G1316C 1290TCC(系列号DEBAC10714)柱温箱、G4226A 1290Samper(系列号DEBAP06788)自动进样器、G4212A 1290DAD(系列号DEBAF04086)检测器]：美国安捷伦公司；CascadaⅠ超纯水仪：美国颇尔公司；5417R型离心机：德国艾本德公司；AB135-S型十万分之一电子天平：德国梅特勒-托利多公司；真空干燥箱：中国南通金石实验仪器有限公司；旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；恒温水浴锅：江苏省常州普天仪器制造有限公司；超声仪：江苏省昆山市超声仪器有限公司。

1.2 试剂与材料 羟基红花黄色素A(批号 wkq16070605)、苦杏仁苷(批号 160210)、芍药苷(批号 150920)、阿魏酸(批号 150526)、毛蕊花糖苷(批号 wkq16062004)、藁本内酯(批号 wkq16051404)：四川省维克奇生物科技有限公司；甲醇、乙腈：瑞典欧森巴克化学公司；超纯水：自制；乙醇：上海润捷化学试剂有限公司；醋酸铵：上海麦克林生化科技有限公司；醋酸：天津市风船化学试剂科技有限公司。

1.3 饮片 熟地黄(批号 1705312、170906、170618)：河南；当归(批号 161108、161223、170514)：甘肃；川芎(批号 1701033、170712、170902)：四川；白芍(批号 1711011、1711025、180116)：安徽；桃仁(批号 1702181、1708011、1711003)：河北；红花(批号 1707213、17090121、1712014)：新疆。以上各批次6味药材均经安徽中医药大学生药教研室俞年军教授鉴定。

2 方法和结果

2.1 混合对照品溶液的制备 分别精密称取对照品羟基红花黄色素A、苦杏仁苷、芍药苷、阿魏酸、毛蕊花糖苷、藁本内酯适量，甲醇定容，制成分别含羟基红花黄色素A、苦杏仁苷、芍药苷、阿魏酸、毛蕊花糖苷、藁本内酯0.50、0.51、0.86、0.47、0.51、0.50 mg/mL的混合溶液。

2.2 供试品溶液的制备 依据《方剂学》(第7版)[12]，按熟地黄、当归、白芍、川芎、桃仁、红花质量比为4∶3∶3∶2∶3∶2的比例共称取17 g药物，煎煮制备供试品溶液。按同样方法，共称取3批，各加入10倍量(容积与质量之比)75%乙醇回流提取2 h，滤过，滤渣用8倍量75%乙醇继续回流提取2 h，合并两次滤液，浓缩，75%乙醇定容至50 mL量瓶中，精密吸取1 mL转移至2 mL量瓶中，超纯水稀释至刻度，精密吸取2 mL于离心管内，15 000 r/min高速离心15 min，取上清液用0.22 μm滤膜过滤，共制备3批供试品溶液。

2.3 色谱条件 采用美国安捷伦公司1290 Infinity超高效液相色谱仪，G4212A 1290DAD(Serial No. DEBAF04086)检测器，Waters ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)。流动相：含7.84 mmol/L乙酸铵的0.05%乙酸水(A)和甲醇溶液(B)。流速：0.2 μL/min。进样量：2 μL。柱温：25 ℃。检测波长：0～4.5 min，403 nm；4.5～9 min，403 nm(用于检测羟基红花黄色素A)和210 nm(用于检测苦杏仁苷)；9～13 min，230 nm；13～18 min，283nm；18～30 min，328 nm。梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系考察 取混合对照品溶液，依次向下稀释2.5、5、12.5、25、62.5倍，按“2.3”项下色谱条件，分别进样，记录色谱图，分别以浓度(x)对峰面积(y)进行线性回归，回归方程、线性范围和相关系数见表2，结果表明进样量与峰面积有良好的线性关系。

表2 线性回归方程

2.4.2 精密度试验 精密吸取混合对照品溶液1 mL，过0.22 μm滤膜，取滤液，重复进样6次，记录色谱图，结果羟基红花黄色素A、苦杏仁苷、芍药苷、阿魏酸、毛蕊花糖苷、藁本内酯峰面积的RSD分别为0.432%、1.265%、0.658%、0.718%、0.970%、0.734%，表明仪器精密度良好。

2.4.3 重复性试验 取同一批样品，按供试品溶液制备项下的方法制备成供试品溶液6份，在上述色谱条件下进行分析测定，结果显示羟基红花黄色素A、苦杏仁苷、芍药苷、阿魏酸、毛蕊花糖苷、藁本内酯峰面积的RSD值分别为0.765%、1.132%、0.633%、0.496%、1.267%、0.379%，结果表明方法的重复性良好。

2.4.4 稳定性试验 分别在0、2、4、6、8、12、24 h供试品溶液进样2 μL，分别计算羟基红花黄色素A、苦杏仁苷、芍药苷、阿魏酸、毛蕊花糖苷、藁本内酯峰面积的RSD，结果分别为1.172%、1.538%、0.845%、0.790%、1.872%、0.699%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.4.5 加样回收率试验 精密称取桃红四物汤药材9份，分别向其中加入低、中、高3种质量浓度的对照品溶液(分别相当于药材原有含量的50%、100%、150%)，每一质量浓度取3份，按“2.2”项方法制备供试品溶液，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，进样测定，计算结果见表3。结果表明该方法的准确度良好。

表3 6种成分的加样回收率

续表3

2.5 桃红四物汤有效成分含量测定 采用相同的桃红四物汤药液提取方法，3批次桃红四物汤药液应用所建立的方法每批重复进样6次，并同时测定桃红四物汤中的6种指标性成分，结果见表4。样品和混标的超高效液相色谱图见图1。

表4 3批次样品含量测定结果(n=6)

3 讨论

阿魏酸具有明显的抗氧化、抗炎等药理活性[13-14]，可用于动脉粥样硬化、心脑血管疾病的治疗[15-16]。桃仁是常用的活血化瘀药物，苦杏仁苷作为其主要的活性成分，具有心血管保护、抗肿瘤、抗纤维化等广泛的药理作用。藁本内酯能明显减少脑缺血再灌注引起的脑梗死体积，改善脑神经功能，并且能减轻大鼠皮质神经细胞和海马神经细胞的损伤[17]，能够舒张血管[18]，改善微循环[19]，具有很强的活血化瘀作用。羟基红花黄色素A是发挥活血化瘀功效的主要有效成分，同时也是药用红花中最有效的水溶性成分[20]，对脑缺血、心肌缺血具有明显的功效，同时也有抗肿瘤、抗氧化、延缓衰老等广泛的药理活性。芍药苷是中医传统补血药白芍的主要药理成分，国内外研究已证明其有降低血液黏度、抗血小板聚集、扩张血管、改善微循环、抗氧化、抗惊厥等多种生物学效应，并且毒性和不良反应较小[21]。毛蕊花糖苷为地黄中代表性苷类化合物，具有保肝、保护心脑血管、延缓衰老、改善记忆力等作用[22]。同时根据《中华人民共和国药典》(2015年版)规定，阿魏酸、苦杏仁苷、羟基红花黄色素A、芍药苷、毛蕊花糖苷分别为当归、川芎、桃仁、红花、白芍、熟地黄的质量考察指标性成分[23]。因此，本研究选择上述优化的条件进行桃红四物汤中6种发挥主要药效的成分进行含量测定。

注：A1、B1、C1在4.5～9 min时检测波长为403 nm，A2、B2、C2在4.5～9 min时检测波长为210 nm；1.羟基红花黄色素A；2.苦杏仁苷；3.芍药苷；4.阿魏酸；5.毛蕊花糖苷；6.藁本内酯

图1空白甲醇(A)、混合对照品(B)和桃红四物汤样品(C)的高效液相色谱图

单一中药的分析通常使用单波长的检测方法，因为主要标志成分通常只有一种或几种化学成分，并且一般具有相似的紫外吸收波长。然而，对于由几种甚至多达十几种中药组成的传统复方，单波长定量分析可能是不够的。以前对中药复方的有效成分研究主要使用单一波长检测或者定量样品中少数化合物。采用多波长融合的方法更加适合对中药传统复方的质量控制。参考《中华人民共和国药典》(2015年版)，羟基红花黄色素A、苦杏仁苷、芍药苷、阿魏酸、毛蕊花糖苷的最大吸收波长分别是403、210、230、316、334 nm[23]。藁本内酯的最大吸收波长为280 nm和328 nm[24-25]。基于二极管阵列检测器的全波长扫描结果，根据检测成分的保留时间和吸收曲线，最终确定了283、403、210、230、328 nm共5种波长进行检测，并选用乙酸铵-乙酸缓冲溶液作为离子调节剂，改善峰形，提高分离度。

本研究采用UPLC-DAD建立同时测定桃红四物汤中6种指标成分含量的方法，具有重复性好、快速、准确的优点，结果表明该方法适用于控制桃红四物汤复方的整体质量，为完善和丰富桃红四物汤复方质量标准提供了科学依据。