正常皮肤与病理性瘢痕组织中HIF-1α和促炎细胞因子水平比较及两者相关性研究

李丽 王林

[摘要]目的：研究正常皮肤和瘢痕组织中乏氧诱导因子-1α（HIF-1α）和促炎细胞因子的水平及二者相关性。方法：选取2015年3月-2017年3月在笔者医院切除的四肢瘢痕疙瘩组织标本为瘢痕疙瘩组;增生性瘢痕组织標本为增生性瘢痕组;普通瘢痕组织标本为普通瘢痕组，同期因四肢外伤切除的正常皮肤组织作为正常组。研究采用HE染色观察炎性细胞浸润情况，RT-qPCR检测病理性瘢痕组织和正常皮肤组织中HIF-1α及促炎细胞因子的蛋白表达水平。结果：瘢痕疙瘩观察组及增生性瘢痕组浸润水平明显高于普通瘢痕组及正常皮肤组（P<0.05），普通瘢痕组与正常皮肤组浸润水平无明显差异（P<0.05），瘢痕疙瘩组浸润水平明显高于增生性瘢痕组（P<0.05）。瘢痕疙瘩组及增生性瘢痕组中HIF-1α、IL-6、IL-8、hs-CRP的mRNA表达水平显著高于正常皮肤对照组（P<0.05），瘢痕疙瘩组HIF-1α、IL-6、IL-8、hs-CRP的mRNA表达量显著高于增生性瘢痕组（P<0.05）。HIF-1α的表达与炎性细胞因子IL-6、IL-8、hs-CRP呈正相关（P<0.05）。结论：病理性瘢痕组织中HIF-1α和促炎细胞因子水平显著高于正常皮肤，且HIF-1α和促炎细胞因子的水平呈正相关性。

[关键词]正常皮肤;病理性瘢痕组织;瘢痕疙瘩;增生性瘢痕;乏氧诱导因子-1α;促炎细胞因子

[中图分类号]R619+.6    [文献标志码]A    [文章编号]1008-6455（2019）04-0071-03

Abstract： Objective  To study the levels of hypoxia-inducible factor-1α （HIF-1α） and pro-inflammatory cytokines in normal skin and scar tissue and their correlation. Methods  The keloid tissue of the extremities excised from the author's hospital from March 2015 to March 2017 was selected as the keloid group; the hypertrophic scar tissue specimen was the hyperplastic scar group; the common scar tissue specimen was the common non-pathological scar group. The normal skin tissue removed by extremity trauma was used as the normal group. The inflammatory cell infiltration was observed by HE staining. The protein expression levels of HIF-1α and proinflammatory cytokines were detected by RT-qPCR in pathological scar tissue and normal skin tissue. Results  The infiltration level of the keloid group and the hypertrophic scar group was significantly higher than that of the normal scar group and the normal skin group. （P<0.05）. There was no significant difference in the infiltration level between the normal scar group and the normal skin group（P<0.05）. The level of infiltration in the observation group was significantly higher than that in the hypertrophic scar observation group（P<0.05）. The mRNA expression levels of HIF-1α，IL-6，IL-8 and hs-CRP in the keloid group and the hypertrophic scar group were significantly higher than the normal skin control group（P<0.05）， the mRNA expression levels of HIF-1α，IL-6，IL-8 and hs-CRP in the keloid group were significantly higher than those in the hypertrophic scar group（P<0.05）; the expression of HIF-1α was positively correlated with proinflammatory cytokines IL-6， IL-8 and hs-CRP（P<0.05）. Conclusion  The levels of HIF-1α and proinflammatorycytokines in pathological scars were significantly higher than those in normal skin， and the levels of HIF-1 α and proinflammatory cytokines were positively correlated.

Key words： normal skin; pathological scar tissue; keloid; hypertrophic scar; HIF-1α; proinflammatory cytokines

病理性瘢痕包括增生性瘢痕和瘢痕疙瘩，是一种人类所特有的真皮纤维化病变，主要以成纤维细胞异常增殖、细胞外基质大量沉积及各类胶原纤维排列紊乱为特征[1]，病理性瘢痕一直是外科修复领域研究的难点与热点。各种细胞因子参与调控病理性瘢痕的形成，如白细胞介素-6（Interleukin-6，IL-6）、白细胞介素-8（Interleukin-8，IL-8）及超敏C反应蛋白（Hypersensitive C-reactive protein，hs-CRP）等炎症因子，炎症反应与病理性瘢痕的形成过程密不可分[1-2]，病理性瘢痕常在乏氧状态下形成，且乏氧诱导因子（hypoxiainducible factor-1α，HIF-1α）也会显著表达[3]，本文通过研究正常皮肤和病理性瘢痕组织中HIF-1α和促炎细胞因子的水平及二者相关性，以探讨病理性瘢痕与炎症的关系。

1  资料和方法

1.1 一般资料：选择2015年3月-2017年3月于笔者医院切除四肢上的瘢痕疙瘩组织标本为瘢痕疙瘩组，共41例，其中男19例，女22例，年龄25～57岁，平均年龄（36.89±9.54）岁;选取39例增生性瘢痕组织标本为增生性瘢痕组，其中男20例，女19例，年龄25～57岁，平均年龄（36.89±9.54）岁;选择25例因外伤切除四肢正常皮肤组织患者为正常组，其中男13例，女12例，年龄22～56岁，平均年龄（34.73±8.52）岁;同期选取22例普通瘢痕组织为普通瘢痕组。纳入标准：①排除垂体、肾上腺疾病，传染病，皮肤病及免疫性疾病者;②入院前未长时间服用抑制瘢痕增生药物等治疗者;③经专业临床医生鉴定为病理性瘢痕者，增生时间为6～12个月。四组患者年龄、性别、BMI值等一般资料比较，差异无统计学意义（P>0.05）。本次研究获得本院医学伦理委员会批准，患者均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 HE染色：除去目的组织的脂肪，制作石蜡切片，水化后苏木精液染色5min，洗去，1%盐酸乙醇水化，水洗，0.5%伊红液染色1～3min，稍洗，再用乙醇、石炭酸二甲苯、二甲苯替代品分别洗涤，然后封片镜检。选取高倍显微镜下每张切片炎性细胞数最多的5个视野，计算分析炎性细胞浸润情况。

1.2.2 RT-PCR法[4]：各取100mg增生性瘢痕组织，瘢痕疙瘩和正常皮肤组织，加入1ml Trizol裂解液后充分研磨，混匀，激烈振荡，冰浴5min，得到组织悬液后加入200μl氯仿，充分震荡后静置，待液体分层后在4℃下以12 000r/min的速度离心10min。吸取上层澄清液后加入等体积异丙醇，轻微震荡后冰浴5min，在4℃下12 000r/min的速度离心10min。弃去上清液，用75%乙醇洗涤RNA，沉淀2次，晾干，用30μl DEPC-H2O溶解RNA沉淀，产物在-20℃下保存用于后续研究。取DEPC溶解的RNA标本，采用cDNA合成试剂盒将RNA反转录为cDNA，然后进行PCR反应，PCR反应条件：94℃ 2min，1个循环;94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 40s，分别扩增HIF-1α、IL-6、IL-8，根据所得PCR反应曲线计算HIF-1α、IL-6、IL-8和hs-CRP的mRNA表达量。

1.3 统计学分析：采用SPSS 22.0统计学软件记录分析数据，组间计量资料采用单因素方差分析，计量资料间相关性分析采用Pearson检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2  结果

2.1 炎性细胞计数及浸润情况：正常皮肤成纤维细胞较少，瘢痕组织内可见编织状排列的大片致密嗜伊红染，同质性粗大胶原纤维，排列紊乱，成纤维细胞增多。瘢痕疙瘩组炎性细胞数为（162.86±27.54）个，增生性瘢痕组炎性细胞数为（112.53±21.35）个，普通瘢痕组炎性细胞数为（58.76±22.35）个，正常皮肤组炎性细胞数为（43.69±16.78）个，瘢痕疙瘩组及增生性瘢痕组炎性细胞浸润水平较正常皮肤组和普通瘢痕组明显升高（P<0.05），且瘢痕疙瘩组炎性细胞浸润水平高于增生性瘢痕组，差异有统计学意义（P<0.05）。

2.2 四组HIF-1α及促炎细胞因子的mRNA表达量：瘢痕疙瘩组及增生性瘢痕组的HIF-1α、IL-6、IL-8和hs-CRP的mRNA表达量显著高于正常皮肤组，差异有统计学意义（P<0.05）;瘢痕疙瘩组HIF-1α、IL-6、IL-8、hs-CRP的mRNA表达量显著高于增生性瘢痕组，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。

2.3 促炎細胞因子与HIF-1α的相关性分析：Pearson相关性分析发现，HIF-α的表达与促炎细胞因子IL-6、IL-8、hs-CRP呈正相关（r分别为0.435、0.521和0.578，P<0.05）。

3  讨论

瘢痕是机体创伤愈合过程中用来填补损伤后缺损的失去正常活性的皮肤组织，瘢痕组织产生过多则成为病理性瘢痕，病理性瘢痕又分为增生性瘢痕和瘢痕疙瘩，是创伤愈合后最常见的并发症之一，瘢痕挛缩可导致不同程度的功能障碍，目前其发病机制尚不明确。两种类型的病理性瘢痕实质上都是以成纤维细胞为主的细胞增殖、活性增强，从而产生大量的胶原蛋白，使真皮层细胞外基质成分在组织中大量沉积，难以被机体吸收或重塑的病理状态[5]。

病理性瘢痕往往容易发生感染，皮肤受损后创面一般会出现炎症反应，并处于微缺氧状态，已有研究表明瘢痕疙瘩常伴随慢性炎症[6]，且微缺氧状态可能与炎症存在一定的相关性[7]。IL-6、IL-8、hs-CRP是促进炎症的关键因子，IL-6又称前炎症细胞因子，可刺激T淋巴细胞的生长与分化，IL-8是一种含有99个氨基酸的蛋白质[8]，可与中性粒细胞、T淋巴细胞等炎性细胞表面受体结合诱导其释放大量溶酶体及过氧化物[9]，hs-CRP是急性炎症反应的标志物，在正常人体内含量极低。2010年，Clogan等[10]人曾报道过组织乏氧会引起水肿，使炎性细胞因子水平增高。乏氧诱导因子是构成HIF-1蛋白亚型的敏感型亚基，在细胞内表达受到氧浓度的控制[11]，局部组织所处的缺氧微环境会使HIF-1α的蛋白表达水平增大，以上显示局部组织发生病理性瘢痕与HIF-1α和促炎细胞因子存在密切关系。本研究发现瘢痕疙瘩和增生性瘢痕组织HIF-1α的mRNA表达含量显著高于正常皮肤组，表明HIF-1α的高表达与病理性瘢痕形成有关，这与胡强等[13]人的报道一致。HIF-1α的mRNA含量高表达原因应该为病理性瘢痕在乏氧环境下，机体损伤时代谢旺盛，以修复损伤的组织细胞，使耗氧量增高，氧气减少，诱导HIF-1α因子的表达[12-13]。在缺氧条件下HIF-1α转位进入细胞核来调节多种靶细胞基因的表达[14]，调控纤维细胞增殖及凋亡。

病理性瘢痕组织中存在大量的炎性细胞，瘢痕疙瘩和增生性瘢痕组织中HIF-1α、IL-6、IL-8、hs-CRP促炎细胞因子mRNA表达含量显著高于正常皮肤组，说明促炎细胞因子的表达与瘢痕形成有关[8]，炎症反应增加细胞的异常分化与过度增殖，参与并促进病理性瘢痕的形成[15]，Simonart等[16]人发现亚抑菌剂量的四环素通过抗炎作用防止痤疮形成瘢痕。且Pearson相关性分析显示HIF-1α分别与IL-6、IL-8、hs-CRP呈正相关，病理性瘢痕组织中HIF-1α因子能够促进促炎细胞因子的表达，增加炎症反应的严重程度，这与叶飞轮[14]及张明子[5]等人研究结果一致。

综上所述，病理性瘢痕组织中HIF-1α和促炎细胞因子的水平与正常皮肤相比显著升高，且HIF-1α和促炎细胞因子的水平呈正相关，病理性瘢痕中HIF-1α水平的升高加剧了炎症反应，病理性瘢痕的形成与炎症反应的发生交叉影响着人体纤维细胞的增殖分化[17]及后续病情发展。

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[收稿日期]2018-12-17