富血小板血浆（PRP）对大鼠光老化皮肤胶原蛋白、TGF-β及MMP-1表达的影响

吴文伯 陈敏亮 吴焱秋 李光磊

[摘要]目的：通過测定注射富血小板血浆（Platelet-rich plasma，PRP）后大鼠光老化皮肤Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白，转化因子β（TGF-β），基质金属蛋白酶1（MMP-1）的表达量，观察PRP对大鼠光老化皮肤的改善作用。方法：通过紫外线照射大鼠背部皮肤建立皮肤光老化模型。将模型动物随机分为5组，A-PRP注射组注射激活的PRP（A-PRP）;N-PRP注射组注射未激活的PRP（N-PRP）;生理盐水注射组注射生理盐水;空白对照组仅照射建模;正常大鼠组仅剃除毛发。干预4周后，通过免疫组化法对大鼠皮肤Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白含量进行半定量分析;通过Western bolt法对大鼠皮肤TGF-β、MMP-1表达量进行测定。结果：Ⅰ型胶原表达：A-PRP注射组较N-PRP注射组、生理盐水注射组、空白对照组显著升高，差异有统计学意义（P<0.05）。Ⅲ型胶原表达：A-PRP注射组显著高于生理盐水注射组、空白对照组（P<0.05），与N-PRP注射组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。TGF-β表达：A-PRP注射组显著高于N-PRP注射组、生理盐水注射组、空白对照组（P<0.05）;MMP-1表达：A-PRP注射组显著低于生理盐水注射组、空白对照组（P<0.05），与N-PRP注射组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。结论：注射PRP可以提高光老化大鼠皮肤Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白和TGF-β表达，降低MMP-1表达，其中A-PRP对Ⅰ型胶原和TGF-β表达的促进作用优于N-PRP。

[关键词]富血小板血浆;光老化;Ⅰ型胶原;Ⅲ型胶原;TGF-β;MMP-1

[中图分类号]R758.1    [文献标志码]A    [文章编号]1008-6455（2019）04-0064-04

Abstract： Objective  The effect of PRP on photoaging skin of mice was observed by measuring the expression of type Ⅰand type Ⅲ collagen， TGF-β， MMP-1 in the skin of mice after PRP injection. Methods   Skin photoaging model was established by irradiating the skin of the back of rats with UV light. A-PRP injection group was injected with activated PRP （A-PRP）. N-PRP injection group was injected with inactive PRP （N-PRP）. Saline injection group was injected with normal saline. Blank control group was irradiated only with UV. Normal rat group only shave the hair. After injection for 4 weeks， the content of collagen type Ⅰ and Ⅲ in rat skin was semi-quantitatively analyzed by immunohistochemistry. The expression of TGF-β and MMP-1 in rat skin was determined by Western blot. Results  The expression of type Ⅰ collagen in A-PRP injection group was significantly higher than that in N-PRP injection group， saline injection group and blank control group， the differences were statistically significant（P<0.05）. The expression of type Ⅲ collagen in A-PRP injection group was significantly higher than that in group saline injection group and blank control group（P<0.05）， and there was no significant difference between A-PRP injection group and N-PRP injection group（P>0.05）. The expression of TGF-β in A-PRP injection group was significantly higher than that in N-PRP injection group， saline injection group and blank control group（P<0.05）， the expression of MMP-1 was significantly lower in A-PRP injection group than that in saline injection group and blank control group（P<0.05）. The expression of MMP-1 in A-PRP injection group and N-PRP injection group had no statistical significance（P>0.05）. Conclusion  Injection of PRP can enhance the expression of type Ⅰ collagen， type Ⅲ collagen and TGF-β and decrease the expression of MMP-1 in the photo-aged rat skin. The effect of A-PRP on the expression of type Ⅰ collagen and TGF-β is better than that of N-PRP.

Key words： platelet-rich plasma（PRP）; photoaging; type Ⅰ collagen; type Ⅲ collagen; TGF-β; MMP-1

皮肤老化分为内源性老化和外源性老化，内源性老化是机体固有的老化，受激素水平等内源性因素影响;外源性老化是皮肤在外界环境因素作用下产生的老化，其中紫外线照射是最主要的影響因素，因此外源性老化也称为光老化[1]。相关研究表明，紫外线照射可以上调基质金属蛋白酶MMP-1表达，加快Ⅰ型胶原分解，使Ⅰ、Ⅲ型胶原比例下降，导致皮肤出现老化表现[2]。

PRP是自体血小板浓缩物，血小板含量是全血的3～8倍，其中富含包括TGF-β在内的多种生长因子[3]。TGF-β能够有效刺激成纤维细胞和间叶母细胞的迁移和增殖分化，促进Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的合成[4]。PRP在骨科、颌面外科、口腔科等领域已经得到了广泛的应用，目前，随着皮肤光老化相关研究的深入，PRP在改善皮肤光老化中的研究和应用也受到关注[5]。本课题将探讨PRP对光老化皮肤Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白，TGF-β及MMP-1表达的影响。

1  材料和方法

1.1 材料

1.1.1 仪器与试剂：UVA紫外线灯管（飞利浦公司）;UVB紫外线灯管（飞利浦公司）;紫外线强度测定仪（台湾路昌）;脱水机（武汉俊杰电子有限公司）;包埋机（武汉俊杰电子有限公司）;病理切片机（德国徕卡）;显微镜（日本尼康）;凝血酶冻干粉（长春雷允上药业有限公司）;枸橼酸钠注射液（天津金耀氨基酸有限公司）;CollagenⅠ抗体（Abcam公司）Collagen Ⅲ抗体（Abcam公司）;TGF-β抗体（Abcam公司）;MMP-1抗体（Abcam公司）;牛血清蛋白Ⅴ（Solarbio公司）。

1.1.2 动物：选取6周龄雄性F344大鼠为模型动物，数量50只，其中30只用于实验，20只用于采血。购自北京维通利华实验动物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 大鼠皮肤光老化模型建立：大鼠5只一笼，于20℃～25℃室温常规饲养，室内光照与昼夜相符。首先进行1周的适应性饲养后，剃除大鼠背部毛发，于自制照射箱中进行照射，根据实验情况和文献报道的照射方案，每周照射5d，累计照射60d[6-8]。起始每天照射15min，每隔10d增加5min，自31d起保持每天30min照射至建模结束。UVA强度：1 500μW/cm?，累计约135J/cm?;UVB强度：150μW/cm?，累计约13.5J/cm?。建模完成后采集皮肤图像和组织标本，对光老化模型进行评价。

1.2.2 富血小板血浆的制备：4%水合氯醛溶液腹腔麻醉大鼠后，剃除胸部毛发后常规消毒，使用预先吸入0.3ml枸橼酸钠溶液的5ml注射器穿刺至左心室，抽取动脉全血3ml，合计60ml，置于5ml离心管中离心。首次以200g离心10min，吸取全部上清液及交界面下3mm液体，置于另一离心试管中进行再次离心，200g离心10min，弃去上3/4液体，剩余1ml摇匀，既得PRP，取少量用于血小板计数。所制得的PRP随机分为2组，一组以凝血酶、10%氯化钙混合物予以激活，得到凝胶状的A-PRP;另一组不予激活，为N-PRP。

1.2.3 PRP注射治疗大鼠光老化皮肤：完成建模后，大鼠常规饲养1周后实施干预。模型大鼠随机进行分组，每组6只。分别为A-PRP注射组，N-PRP注射组，生理盐水注射组，空白对照组，除上述4组外，另随机抽取6只正常大鼠为正常大鼠组。

4%水合氯醛腹腔麻醉大鼠，于照射区域标定3cm×3cm大小区域，胰岛素针抽取1ml注射物，进行真皮层内注射，每只大鼠均匀注射20个点，每点注射0.5ml，A-PRP注射组行A-PRP注射，N-PRP注射组行N-PRP注射，生理盐水注射组注射生理盐水，空白对照组及正常大鼠组不注射。

1.2.4 免疫组化法检测Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白表达：注射4周后，大鼠常规饲养1周，处死后取皮肤标本。SP二步法对Ⅰ、Ⅲ型胶原进行染色，每个标本随机选取3张切片，每张切片高倍镜下观察3个视野，合计每组54个视野。以Image Pro Plus 6.0软件对切片图像进行分析，检测Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白表达的平均光密度值，取每组平均值进行比较。

1.2.5 Western bolt法检测TGF-β、MMP-1表达：以Image J图像分析软件对各组条带吸光度值进行分析，从而测定TGF-β、MMP-1的表达情况。

1.2.6 统计学分析：所有数据使用SPSS 17.0进行分析处理，计量资料以均数±标准差表示，采用方差分析。P<0.05认为差异有统计学意义。

2  结果

2.1 大鼠光老化模型建立结果：累计照射60d后，大鼠背部皮肤出现深大的静态皱纹和色素沉着，组织学观察可见大鼠皮肤真皮厚度显著减低，表皮不规则增厚，胶原纤维数量减少、排列紊乱，炎性细胞大量浸润，符合皮肤光老化特征。

2.2 免疫组化检测Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白表达结果：各组标本均可见不同程度的Ⅰ型和Ⅲ型胶原纤维染色，胶原纤维染色呈灰褐色。Ⅰ型胶原染色可见，A-PRP注射组改善最为明显，胶原纤维排列规律、紧密;N-PRP注射组优于生理盐水注射组，空白对照组但少于A-PRP注射组;空白对照组和正常大鼠组差异不明显。

Ⅰ型胶原纤维平均光密度值检测结果显示：A-PRP注射组（4.63）高于生理盐水注射组（3.86）、空白对照组（3.94），差异有统计学意义（P<0.01）;A-PRP注射组（4.63）高于N-PRP注射组（4.24），差异有统计学意义（P<0.05）;A-PRP注射组（4.63）与正常大鼠组（5.07）比较，差异无统计学意义（P>0.05）。

Ⅲ型胶原纤维染色结果变化趋势与Ⅰ型胶原基本相同，A-PRP注射组（4.43）显著高于生理盐水注射组（3.97）、空白对照组（3.94），差异有统计学意义（P<0.01），但A-PRP注射组（4.43）、N-PRP注射组（4.32）比较，差异无统计学意义（P>0.05）。A-PRP注射组（4.43）与正常大鼠组（4.76）比较，差异无统计学意义（P>0.05）。

2.3 Western bolt法检测TGF-β、MMP-1表达结果：通过条带吸光度值分析TGF-β和MMP-1的表达。A-PRP注射组较生理盐水注射组、空白对照组TGF-β表达显著增高（P<0.01），MMP-1表达显著下降（P<0.01）;A-PRP注射组较N-PRP注射组TGF-β表达显著增高（P<0.05），MMP-1表达无显著差异（P>0.05）;与正常大鼠组比较，A-PRP注射组TGF-β表达无显著差异（P>0.05），MMP-1表达显著增高（P<0.05）。

3  讨论

真皮中的胶原纤维主要是Ⅰ型和Ⅲ型胶原纤维，其中Ⅰ型占80%，是维持皮肤张力的主要部分，Ⅲ型胶原纤维是幼稚的胶原纤维，主要构成网状纤维[9-10]。既往的研究表明，紫外线照射首先可以诱导成纤维细胞和角质细胞表达IL-1、TNF-α等炎症因子，这些炎症因子通过激活NF-κB通路和MAPK通路上调基质金属蛋白酶MMPs的表達。MMPs是一类锌依赖的蛋白酶家族，在细胞外基质的分解和改建中发挥着重要作用。MMP-1可以特异性的将Ⅰ型胶原蛋白初步分解，并且其分解产物也能够抑制Ⅰ型胶原蛋白的表达，因此MMP-1的增加被认为是皮肤光老化过程中的核心环节[7，11-12];其次，紫外线可以造成皮肤组织活性氧ROS堆积，造成细胞的凋亡和DNA的损伤，诱发基因突变甚至皮肤肿瘤的发生;最后，紫外线还能够上调AP-1，抑制TGF-β/Smad通路，TGF-β是抑制皮肤光老化的最主要生长因子之一，TGF-β能够刺激成纤维细胞的增殖，促进Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白和透明质酸的合成，同时TGF-β还能够下调蛋白酶的表达并增强其抑制物的活性，从而减少细胞外基质的降解[13]。

PRP是自体血经过离心后获得的血小板浓缩物，血小板α颗粒内含有TGF-β、PDGF、VEGF、IGF、EGF等大量生长因子和细胞因子，在诱导细胞趋化和新生血管形成、促进细胞增殖分化、增强细胞外基质合成等组织修复环节中发挥着核心作用[14]。当PRP被激活后，α颗粒内的生长因子和细胞因子大量快速释放，在TGF-β等因子的趋化作用下，炎性细胞、成纤维细胞和其他未分化细胞聚集于给药区域，炎性细胞吞噬变性坏死的组织成分，为成纤维细胞和未分化细胞的粘附提供有利环境;成纤维细胞等粘附于基质后，生长因子与细胞表面受体结合，通过信号通路转导，促进细胞的增殖分化并上调Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白、透明质酸以及其他细胞外基质成分的合成，增强MMPs抑制物TIMP的表达，抑制MMPs对细胞外基质的降解作用[4]。PRP根据是否通过外源激活物激活可分为A-PRP和N-PRP，在体外，如开放性创面、窦道等使用PRP必须经过激活，而在体内注射PRP是否需要激活仍然存在争议[15]。

本课题中，A-PRP注射组和N-PRP注射组相比生理盐水注射组和空白对照组，Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白TGF-β表达显著升高，MMP-1表达显著下降，其中Ⅰ型胶原蛋白和TGF-β表达A-PRP高于N-PRP，而Ⅲ型胶原蛋白和MMPs表达两者无显著差异。综合以上结果，说明PRP能够通过促进光老化皮肤Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白和TGF-β表达，抑制MMPs表达而对光老化皮肤起到改善作用。

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[收稿日期]2017-12-18