大承气汤对支气管哮喘及肺肠合病Treg/TH17免疫机制的作用

李继红，王小莉，霍吉尔，吴秀明

(1.吉首大学医学院，湖南 吉首 416000；2.张家界市人民医院呼吸内科，湖南 张家界 427000)

“肺与大肠相表里”是中医学“藏象学说”中的重要理论，认为肺与大肠通过经脉的互为络属而构成表里关系，在功能上相互联系，在病变上揭示了人体脏腑之间相互影响、相互作用的关系[1-2].支气管哮喘(简称哮喘)是一种以气道高反应性和气道炎症为主要特征并反复发作的呼吸道常见疾病.近年来，肠道功能与哮喘的相互关系研究很受关注[3-4].中医学理论认为，哮喘可因肺失肃降和气机潴滞而影响大肠的传导功能，导致腑气不通.另外,肠腑滞实，以致浊气不降而上逆，进而影响肺的肃降功能，加重哮喘发病[5].研究表明，肠道细菌不同类群的构成与婴幼儿的过敏易感性增强和哮喘发生有关[6-7]，提示哮喘发病与肠道功能存在相互影响、相互作用的关系，但探究肺与肠道之间共同粘膜免疫物质联系的研究较少，哮喘发病时肺与大肠相关性的物质基础尚不明确，具体发病机制仍不明确.笔者以大承气汤通肠利肺作用为切入点，在大承气汤方药干预下，观察哮喘及肺肠合病大鼠动物模型肺与大肠之间共同免疫物质TH17/Treg的变化，从而探讨“肺与大肠相表里”的免疫机制.

1 材料

1.1 动物

雄性Wistar大鼠75只，SPF级，体质量(180±20)g.购自成都达硕生物科技有限公司，物合格证号：scxk(m)2008-15.

1.2 药物及试剂

1%卵清蛋白(OVA，Sigma产品)；氢氧化铝(成都市科龙化工试剂厂，批号20080807)；复方地芬诺酯片(焦作市博爱药业有限公司，批号09033001).

1.3 仪器及设备

称重天平(ACS-3C型，广州中山市新和基科技开发有限公司)；超声雾化器(WH-203型，广州粤华医疗器械有限公司).

2 方法

2.1 建立哮喘组/肺肠合病组/大承气汤干预组哮喘动物模型

将75只大鼠随机分为对照组(A)、哮喘组(B)、肺肠合病组(过敏性哮喘合便秘) (C)、大承气汤哮喘干预组(哮喘干预组)(D)与大承气汤肺肠合病干预组(肺肠合病干预组)(E)5组，每组大鼠15只.

(1)哮喘组.将1 mg OVA和200 mg氢氧化铝溶于1 mL生理盐水中,配制成新鲜的凝胶致敏剂,分别于第1天和第7天在大鼠双侧胸部及腹股沟4点皮下注射各0.15 mL,同时腹腔注射0.4 mL,共计1 mL进行致敏. 第14天开始将大鼠置于有机玻璃盒内,超声雾化吸入1% OVA诱发哮喘,每天1次,每次30 min,共计1周,以大鼠出现烦躁、打喷嚏、咳嗽、腹肌强烈收缩、呼吸急促等典型哮喘样发作症状为标准.对照组给予生理盐水.

(2)肺肠合病组.灌胃给予复方地芬诺酯(剂量10 mg/kg),隔天1次.同样,第1天和第7天注射上述致敏剂,第14天开始雾化,具体方法同哮喘组.以粪便干燥、粒形缩短、排出费力，日排出量低于正常参考值范围(4.28～11.18 g) 为诊断大鼠便秘的标准[8].

(3)大承气汤哮喘干预组(哮喘干预组)：15只大鼠同哮喘组处理，大鼠每次激发前30 min以大承气汤灌胃，连续7天.

(4)大承气汤肺肠合病干预组(肺肠合病干预组)：15只大鼠同肺肠合病组处理，大鼠每次激发前30 min以大承气汤灌胃，连续7天.

2.2 观察各组大鼠及其体内Th17/Treg免疫失衡状态

用免疫磁珠法分别提取大鼠外周血淋巴细胞，CD4+CD25+Foxp3+标记Treg细胞，CD4+抗IL-17A +标记Th17细胞，用流式细胞术测定2种细胞的数量与比例.用ELISA法检测外周血清中 IL-17,IL-6,IL-2的水平.

3 结果

3.1 各组肺组织的病理切片(HE)染色

正常对照组气道结构清晰，气道内未见粘液分布及粘液栓形成；气道纤毛上皮排列整齐，粘膜皱襞无水肿，无明显的炎症及胶原纤维沉积.哮喘组及肺肠合病组大鼠支气管及血管周围大量炎性细胞浸润；肺间质及肺泡中可见中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞浸润；气道上皮损伤，结构紊乱，气道内杯状细胞肥大增生；气道内分泌大量粘液，粘液栓形成，粘膜下胶原纤维沉积，气道平滑肌细胞增生.大承气汤干预后，哮喘干预组与肺肠合病干预组大鼠气管及血管周围炎性细胞浸润程度明显减轻，气道内分泌物减少，粘膜下胶原纤维沉积与气道平滑肌细胞增生减轻.

图1 大鼠肺组织的病理切片(HE)染色Fig. 1 Pathological Section of Rat Lung Tissue (HE) Staining

3.2 Th17/Treg亚群分布测定

流式细胞术检测结果如图2所示.由图2可知：与对照组(A)比较，哮喘组(B)及肺肠合病组(C)大鼠外周血淋巴细胞中Th17细胞比例升高，Treg细胞比例降低，且肺肠合病组(C)大鼠更明显，差异有统计学意义(P<0.05).在大承气汤干预下，哮喘干预组(D)与肺肠合病干预组(E)Th17细胞比例降低，Treg细胞比例升高，差异有统计学意义(P<0.05).

图2 大鼠外周血淋巴细胞中Th17细胞比例与Treg细胞比例Fig. 2 Proportion of Th17/Treg in Lymphocytes of Rat Serum

3.3 外周血清中 IL-17,IL-6,IL-2水平

实验结果如图3所示.由图3可知：与对照组(A)及大承气汤组干预(D，E)比较，哮喘组(B)及肺肠合病组(C)大鼠血清中IL-6,IL-17水平升高，IL-2水平降低；肺肠合病组(C)大鼠血清中IL-6，IL-17水平升高，IL-2水平降低更明显，差异有统计学意义(P<0.05).与哮喘组(B)及肺肠合病组(C)比较，哮喘干预组(D)与肺肠合病干预组(E)血清中IL-6，IL-17水平下降,IL-2水平升高，差异有统计学意义(P<0.05).

图3 大鼠血清中IL-17，IL-6，IL-2水平Fig. 3 Levels of IL-17, IL-6, and IL-2 in Rat Peripheral Blood

4 讨论

Th17/Treg 细胞失衡是哮喘发病的重要原因，也是目前研究的热点[9-10].Th17细胞及IL-17与哮喘关系密切,哮喘患者的血清、肺泡灌洗液及支气管活检免疫组化均表明IL-17和(或)IL-17 mRNA增加,并且与患者气道高反应性的严重程度相关[11].在本实验中，笔者发现，与哮喘组大鼠相比较，肺肠合病组大鼠支气管肺组织中炎症细胞浸润明显，外周血中Th17细胞升高比例与Treg细胞降低比例较哮喘组更明显.血清IL-17，IL-6水平明显增加，提示在哮喘发病，尤其是当肠道菌群及其功能变化导致肠道的微生态及其免疫变化时,大量的细菌穿过肠道粘膜，进一步激发T细胞，T17和Treg的分化失衡，免疫反应向呼吸道粘膜等部位迁移,在粘膜淋巴细胞的“归巢”作用下，呼吸道产生强而广泛的粘膜免疫应答，诱发机体免疫紊乱，使得支气管哮喘的炎症反应得以发生、发展以致加重.

笔者认为，肺肠合治需调节肺肠气机的升降平衡，大承气汤可宣发肺之肃降，承顺大肠腑之气.现代药理研究认为大承气汤具有显著的抗炎、抗菌、解热、抗氧化、提高机体免疫力，抑制内毒素产生致炎因子，通腑保肺等作用.本实验中，在大承气汤干预下，哮喘干预组和肺肠合病干预组Th17细胞比例明显降低，Treg细胞比例升高，IL-6，IL-17水平下降，IL-2水平升高，提示大承气汤通过调节哮喘发病中的TH17/Treg平衡来调节各种细胞因子，控制体内炎症反应，调节肺肠气机的升降平衡，宣肺(升清)通腑(降浊)，升降脏腑气机的出入，以顺应肺主宣发肃降，促邪外出，调整肺肠气机清浊升降逆乱，使痰饮积滞得以降泄，从而有利于恢复肺之宣肃功能，是治疗哮喘发作的一种有效方法.

笔者以大承气汤通肠利肺作用为切入点，研究发现哮喘发病可影响肠道TH17/Treg的变化，肠道功能紊乱也可反过来影响到哮喘发病，大承气汤通过调节TH17/Treg的免疫作用，提高黏膜屏障功能，降低淋巴细胞的“归巢”作用，减轻哮喘发病.总而言之，本研究结论可为肺肠合病相关理论的分子机制研究提供了一条可行的途径，为哮喘的整体治疗提供实验依据.