乳酸菌发酵柑橘皮的工艺研究及优化

崔欣悦，凌空，周明，王雨晴，谷瑞增，陆路

（中国食品发酵工业研究院有限公司，北京市蛋白功能肽工程技术研究中心，北京100015）

我国是柑橘主要原产国之一，有着长达4 000 余年的种植史，种植面积及总产量位居世界第一（2016年产量达3600 万吨）[1]。柑橘类产品因易剥皮和口感良好等优势受到消费者青睐。近年来，随着柑橘加工产业的发展，非冷冻浓缩汁（non-frozenconcentrate，NFC），罐头，蜜饯和果酒等加工产品地位不断上升。柑橘皮做为主要加工副产物，约占主要果重的25%～40%，主要由黄酮类物质，纤维素，果胶，维生素C，类胡萝卜素和果胶等成分组成[2]，具有良好的利用价值。而在我国，对于柑橘皮的处理主要采用填埋处理方法，不再进行进一步的深加工处理，造成环境的严重污染和资源浪费[3]。

陈皮，又名橘皮、贵老、红皮、黄橘皮、广橘皮、新会皮、柑皮、或广陈皮，是芸香科柑橘属植物橘及其栽培变种的干燥成熟果皮。市场中常见的陈皮主要分为川陈皮，广陈皮，江西陈皮等，主要产于我国四川、江西、广东和湖南等地。陈皮因具有健脾理气，燥湿化痰等功效常被用于传统中药当中。陈皮中主要活性成分为黄酮类物质及其挥发油。黄酮具有多种生物活性，特别是在抗肿瘤、降血脂和抗氧化等方面[4-6]。中医理论认为“陈久者良”即其贮存时间越久其药理活性越强，其中的黄酮类物质含量会随着储存时间的增加而增加[7]，这也使得年份较久的陈皮价格相对于年份较短的价格要高出很多。

本试验以柑橘皮做为原料，5 种实验室自行分离鉴定的乳酸菌做为出发菌，利用微生物发酵技术将其中黄酮类物质进行提取并尽可能提高其含量，再与市售陈皮中的黄酮含量进行对比，随后通过单因素、响应面等试验方法，对其发酵过程条件进行优化，以寻得最佳发酵工艺手段。为开发利用柑橘皮中的主要活性物质资源，发展高效微生物发酵手段奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

柑橘皮：市售；菌种：5A-1-1（类干酪乳杆菌）；1C-2（短乳杆菌）；ff001（植物乳杆菌植物亚种）；ff002（嗜酸乳杆菌）；ff003（肠膜明串珠菌肠膜亚种）：均来自实验室内自行鉴定保藏；MRS 培养基：北京奥博星生物技术有限责任公司；川陈皮素、桔红素、芦丁、金丝桃苷、槲皮素、木犀草素、柚皮素、芹菜素和异鼠李素，纯度均≥99%：上海源叶生物技术有限公司；甲醇、乙腈（色谱纯）：德国Merck；甲酸（色谱纯）：迪马科技；乙酸铵（质谱纯）：Sigma-Aldrich；试验用超纯水（18.2 MΩ·cm）由Milli-Q 纯水系统制备。

pH 计（S20P 型）：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；粉碎机（JS39D-250 型）：苏泊尔电器；生物安全柜（1389A2 型）：美国Thermo；恒温震荡培养箱（HZQ-211C 型）：上海一恒科学仪器有限公司；水浴锅：苏州珀瓦尔实验设备有限公司；超高效液相色谱仪Nexera X2、三重四极杆质谱仪联用系统（具体包括：LC-30AD×2 输液泵，SIL-30AC 自动进样器，CTO-20AC柱温箱，CBM-20A 系统控制器，LCMS-8060 三重四极杆质谱仪，LabSolutions Ver. 5.91 色谱工作站）：岛津（上海）实验器材有限公司；分析天平（XS205DU 型）：美国Mettler Toledo；涡旋混合仪（QL-901 型）：中国其林贝尔仪器制造有限公司

1.2 试验方法

1.2.1 发酵柑橘皮工艺流程

发酵柑橘皮的工艺流程如图1所示。

图1 柑橘皮发酵工艺流程Fig.1 The fermentation process of citrus peel

1.2.2 柑橘皮发酵液中黄酮含量的测定

分别准确称取9 种黄酮标准品粉末20.0 mg，加甲醇溶解，涡旋混匀，定容至100 mL，即得200 μg/mL 的标准储备液。分别取500 μL 上述标准储备液，定容至10 mL，得到混合标准中间工作液10 μg/mL。将上述混合标准中间工作液用纯甲醇逐级稀释至0.98、1.95、3.91、7.81、15.63、31.25、62.5、125、250 ng/mL 的系列标准工作溶液。

液相色谱条件：色谱柱：Shim-pack GIST（2.1 mm I.D.×100 mm L.，3 μm）；流动相：A 为0.1%甲酸、1 mmol/L乙酸铵水溶液，B 为0.1%甲酸乙腈溶液；梯度洗脱程序：B 相初始浓度为20%；0～6.0 min，20%～50%B；6.0 min～8.0 min，50%～80%B；8.0 min～8.1 min，80%～100%B；8.1 min～10 min，100%B；10 min～10.1 min，100%～20%B；10.1 min～14 min，20%B；流速：0.2 mL/min；进样体积：1 μL；柱温：40 ℃。质谱条件：离子化模式：ESI；加热模块温度：400 ℃；雾化气流速：3.0 L/min 干燥气流速：10.0 L/min；接口电压：4 kV；加热气流速：10.0 L/min；DL 温度：250 ℃；接口温度：300 ℃。

1.2.3 单因素试验

选择发酵前后黄酮含量变化最高的一株单菌种进行单因素试验考察，分别对碳源添加量、接种量、发酵时间及皮水比进行考核，探究相关因素对发酵过程中橘皮总黄酮（mg/g）含量的影响，确定各单因素合适的发酵条件，为柑橘皮中总黄酮含量的提高提供参考范围，每个因素设置3 个平行。

1.2.4 响应面分析试验

通过单因素试验结果确定响应面试验设计的因素和水平，选取碳源添加量（A），接种量（B），发酵时间（C）为试验因素。采用中心组合试验Box-Behnken 设计试验因素与水平，如表1所示，试验结果用Design Expert 8.1 分析，确定各因素及因素之间的交互作用对橘皮中总黄酮含量的影响，优化发酵工艺条件[8-9]。

表1 Box-Behnken 试验设计Table 1 Design of Box-Behnken experiment

2 试验结果

2.1 菌种的筛选

利用三重四极杆质谱仪联用系统条件对5 株不同乳酸菌发酵的柑橘皮发酵液进行黄酮含量测定，其测定结果见图2。

如图2所示，利用三重四级杆液质联用仪对5 株单菌在发酵过程中9 种不同黄酮类物质的含量变化进行测定。发酵液中检测到的川陈皮素、桔红素及芦丁含量较高，其中不同菌株在发酵过程中的川陈皮素含量均有所升高，菌株5A-1-1 变化尤为明显。相对于川陈皮素而言，发酵液中的槲皮素、金丝桃苷、木犀草素、芹菜素、异鼠李素及柚皮素等含量较低，在发酵过程中各菌株变化趋势不同，且通过图2b 及图2g可以发现，随着发酵时间的增加ff002 中的槲皮素及ff001 中的芹菜素在发酵后期的含量降至0 μg/kg，这说明乳酸菌在发酵过程中充分分解利用了这部分的黄酮以满足自身的生长所需。黄酮类物质含量随着发酵过程中交替增减，可以推测在乳酸菌的作用下，柑橘皮中的黄酮产生了复杂形势的生物转化。

图2 发酵过程中不同种类黄酮含量测定Fig.2 The concentration of different kinds of flavonoid during fermentation process

采用液相色谱对不同菌株发酵过程中总黄酮含量的变化进行测定，测定结果如图3所示。

图3 发酵液中总黄酮含量测定Fig.3 The content changes of total flavonoids

同时，对总黄酮的变化量进行计算（图3），同起始发酵液中的总黄酮浓度相比，含5 株单菌的发酵液中的总黄酮含量均有增加，其中5A-1-1 变化含量与其他单菌相比最为明显，由0.132 mg/g 变化至0.174 mg/g。综合分析发现，菌株5A-1-1 在发酵过程中的黄酮含量显著升高，继而选为最优菌用于单因素试验及响应面分析。

2.2 单因素影响试验

2.2.1 碳源添加量的影响

在接种量为3%、发酵时间为5 d、皮水比为1 ∶4（质量比）的条件下，不同比例的碳源添加量对发酵液中总黄酮含量影响见图4。

图4 碳源添加量对发酵液中总黄酮含量的影响Fig.4 Effect of carbon sources addition on the content of total flavonoids in orange peel

当碳源添加量为总体积分数的3%时，发酵液中的总黄酮含量最高，随后随着碳源添加的增加而减少，说明在一定添加量的基础上，碳源的增加不会提高橘皮发酵液中总黄酮的含量，可能会使黄酮在发酵液中分解，考虑到这一点，遂选取2%、3%、4%的碳源添加量进行响应面分析。

2.2.2 接种量的影响

在碳源添加量为3%、发酵时间为5 d、皮水比为1 ∶4（质量比）的条件下，考察不同接种量比例对发酵液中黄酮含量的影响如图5所示。

图5 接种量对发酵液中总黄酮含量的影响Fig.5 Effect of inoculum concentration on the content of total flavonoids in orange peel

研究结果表明，随着接种量的升高，发酵液中的黄酮含量在接种量为3%时达到最高为0.198 mg/kg，随后逐渐下降，故选择接种量为2%、3%、4%做响应面分析。

2.2.3 发酵时间的影响

在碳源添加量为3%、接种量为3%、皮水比为1 ∶4（质量比）的条件下，不同发酵时间对发酵液中黄酮含量的影响如图6所示。

图6 发酵时间对橘皮中总黄酮的影响Fig.6 Effect of fermentation time on the content of total flavonoids in orange peel

由图6可知，当发酵时间为2 d 时，发酵液中的黄酮含量最高为0.19 mg/kg，随着发酵时间的增加，发酵液液中的黄酮含量逐步减少，这可能由于培养基中相关营养成分被消耗，菌种还是利用黄酮以满足自身代谢需求，选择1、2、3 d 为发酵时间进行响应面分析。

2.2.4 皮水比的影响

在碳源添加量为3%、接种量为3%、发酵时间为5 d 条件下，不同比例的橘皮与水的皮水比对发酵液中黄酮含量的影响如图7所示。

图7 皮水质量比对橘皮中总黄酮的影响Fig.7 Effect of solid-liquid mass ratio on the content of total flavonoids in orange peel

由图7可知，皮水比为1 ∶4（质量比）时得到的发酵液总黄酮含量最高。测定结果表明，过低皮水比1 ∶1（质量比）或过高皮水比1 ∶8（质量比）均会影响发酵液状态。当皮水比过低时由于底物浓度过大，会对酶的催化起到抑制作用，同样，当皮水比过高时，酶浓度过低，酶解反应不够充分，导致发酵液中总黄酮的含量降低。综合考虑，为得到总黄酮含量较高的发酵液，在进行响应面试验时，将选择1 ∶4（质量比）的皮水比进行试验，不再考虑其他皮水比。

2.3 响应面试验结果与方差分析

根据Box-Behnken 中心组合试验设计原理，综合上述单因素试验结果，进行三因素三水平响应面试验，结果如表2所示，对数据的方差分析结果见表3。

表2 响应面法试验设计及结果Table 2 Design and result of response surface experiment

表3 方差分析结果Table 3 Analysis of variance for quadric regression model

利用Design-Expert 8.0 软件，对上述试验结果进行二次回归拟合，建立的回归方程如下所示：

Y=-0.312 22+0.141 87A+0.165 62B+0.109 50C+0.018755AB+3.45000×10-3AC-0.020758BC-0.031467A2-0.024 425B2-0.014 765C2。（式中Y：总黄酮含量预测值；A、B、C分别代表碳源添加量、接种量、发酵时间的编码值。）

从表3 方差分析结果可得出，整体模型的F=78.94，P＜0.000 1，表明试验所采用二次回归方程模型高度显著，在统计学上有意义。试验的失拟项P=0.218 4＞0.05，无失拟因素存在，对模型有利。同时该模型方程决定系数R2=0.990 2，表明回归方程拟合程度良好，自变量与响应面之间线性关系显著，能够用于橘皮中总黄酮含量检测试验的理论预测[10]。对比影响总黄酮含量的因素为：碳源添加量（A）＞接种量（B）＞发酵时间（C）。

采用Box-Behnken 试验模型对碳源添加量、接种量、发酵时间3 个因素交互作用进行分析，分析结果如图8所示。

由图8可以看出，对碳源添加量、接种量、发酵时间3 个因素交互作用分析，得到了交互因子的响应曲面图。其分析表明等高线图均为椭圆形，响应面三维图均有稳定点，且为极大值。结果显示接种量和碳源添加量、接种量和发酵时间均具有交互性（P＜0.05），碳源添加量和发酵时间的交互作用不具有显著性（P＞0.05）。通过数据的处理分析，得到响应面R 的最大预测值为0.214 247mg/g，此时碳源添加量为3.25%、接种量2.97%、发酵时间2 d。为检验模型的准确性，采用优化后的最佳发酵条件进行试验，3 次试验检测出的总黄酮含量平均值为（0.208 667±0.008）mg/g。实际值与预测值接近，说明该回归模型优化的发酵工艺是有效的。

图8 Box-Behnken 试验模型响应面三维图和等高线图Fig.8 Response surface three-dimensional diagrams and contour maps of Box-Behnken experiment

3 讨论与结论

本研究以新鲜柑橘皮为主要发酵原料，利用试验室5 种不同乳酸菌对其进行发酵试验，通过LC-MS 对培养过程中发酵液中的黄酮类物质进行检测，结果表明柑橘皮中富含多种黄酮类物质成分，其中以川陈皮素、桔红素及芦丁为主。川陈皮素及桔红素是多甲氧基黄酮中的两类常见物质，其广泛存在于柑橘属植物中，由于其具有抗炎、抗氧化、抗癌、抗诱变等生理活性[11-13]，近年来得到了国内外学者的较多专注，Whitman SC 等[14]研究发现川陈皮素可有效减少血浆胆固醇在体内的富集，从而抑制巨噬细胞的形成来阻止抗动脉粥样硬化。李兰英等[15]研究表明陈皮中多甲氧基黄酮类成分可以抑制人肝癌细胞株SMMC-7721 及HepG2 细胞的生长，并对其增殖呈现时间和浓度的依赖性。

采用5 种实验室常见乳酸菌菌种进行前期初步筛选，通过发酵液中黄酮含量的对比筛选出发酵性能优良的一株乳酸菌（5A-1-1），在一定皮水比前处理的基础上，探究柑橘皮发酵最佳工艺条件，确定碳源添加量、接种量及发酵时间的最佳组合，其最佳发酵工艺条件为：碳源添加量为3.25%、接种量2.97%、发酵时间2 d，皮水比1 ∶4（质量比），在该发酵条件下可有效提高发酵液中总黄酮含量，其得率由0.17 mg/g 提高至0.208 mg/g。

本试验通过发酵手段及对发酵条件的有效控制实现对柑橘皮的深加工处理，提高了生物转换效率，最大程度实现其本身功能物质的转化和利用，避免了环境污染与资源浪费，同时为今后利用柑橘皮发酵工艺实现产业化生产奠定了基础。