HPLC测定鱼腥草素钠栓中鱼腥草素钠三聚物的方法研究

2019-04-12张锡霞李永贵

食品与药品 2019年2期

张锡霞，李永贵，王晶

（山东省药学科学院山东省化学药物重点实验室，山东济南 250101）

鱼腥草为三白草科蕺菜属植物蕺菜的新鲜全草或干燥地上部分，有清热解毒、消肿排脓、利尿通淋的功效，用于肺痈吐脓、痰热喘咳、热痢热淋、痈肿疮毒[1]。其功效主要与其抗病原微生物、抗炎、调节免疫功能等药理作用相关[2]。鱼腥草的有效成分是其挥发性物质，通过质谱学确定其结构，其主要有效成分为癸酰乙醛（鱼腥草素）和2-十一烷酮(甲基正壬酮）[3]。癸酰乙醛具有抗病原微生物的活性，但由于化学性质不稳定，易聚合，于是通过人工合成制得了癸酰乙醛的亚硫酸氢钠加成物即鱼腥草素钠[4]。

鱼腥草素钠栓为乳白色或微黄色的卵形栓剂，为抗感染类药，消炎效果好，副作用小，用于治疗子宫颈糜烂有特效[5]。西安澜泰药业有限公司于2006年率先获得了鱼腥草素钠栓的生产批准文号。

因鱼腥草素钠含有化学性质活泼的醛酮结构，易发生聚合、氧化等多种降解反应。通过参考文献，根据降解动力学及缩合反应机制，鱼腥草素中含有二分子羟醛缩合产物（二聚物），但二聚物为缩合过程中的中间过渡状态，缩合产物以稳定的鱼腥草素钠三聚物（三聚物）形式存在[6-7]。由于鱼腥草素钠栓国家标准WS-10001-（HD-1078）-2002中无有关物质检查项[8]，故将三聚物作为鱼腥草素钠栓有关物质考察对象，参考缩合反应机制，制备三聚物；同时通过氢谱、碳谱、质谱，确定其结构，建立了三聚物检查的HPLC法，进行了相应的方法学验证[9]。

1 仪器与试药

1.1 仪器

高效液相色谱仪带有LC-20AT型泵、SPD-20A型紫外检测器、SIL-20A型自动进样器、CTO-10AS vp型柱温箱、LC SoLution液相色谱数据工作站（日本岛津公司）；BT125D型电子天平（德国Sartorius公司）；pHSJ-3F型酸度计（上海雷磁仪器厂）；KQ5200B型超声波清洗器（昆山超声仪器公司，功率：200 W，频率：40 kHz）；艾柯实验室超纯水机（成都艾柯）。

1.2 试药

鱼腥草素钠对照品（中国食品药品检定研究院，批号100247-199601）；鱼腥草素钠栓（自制，规格：20 mg，批号120301，120302，120303）；三聚物对照品（自制，批号：YXCSJW-1，纯度：98.19%）；甲醇（山东禹王）；超纯水（自制）。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 三聚物对照品溶液的制备精密称取三聚物对照品约10 mg，置入100 ml量瓶，加甲醇少许，超声，使完全溶解，以甲醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液。精密移取1 ml置入100 ml量瓶，以甲醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液的配制取鱼腥草素钠栓10粒，切成小片，精密称取适量（约相当于鱼腥草素钠0.02 g），置入100 ml量瓶，加甲醇少许，将量瓶置热水浴中，轻轻振摇使完全溶解，取出，放冷至室温，以甲醇稀释至刻度，摇匀。将量瓶置冰水浴中冷却20 min，以0.45 µm的有机滤膜过滤，弃去初滤液，续滤液放至室温，精密量取1 ml，置入10 ml量瓶，以甲醇稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

2.1.3 系统适用性溶液精密称取鱼腥草素钠对照品约20 mg，置入100 ml量瓶，加甲醇少许，超声，使完全溶解，以甲醇稀释至刻度，摇匀，作为鱼腥草素钠对照品储备液。精密移取2.1.1项三聚物对照品储备液1 ml，置入10 ml量瓶，加甲醇稀释至刻度，摇匀；精密移取此溶液1 ml及鱼腥草素钠对照品储备液1 ml，置入同一10 ml量瓶，以甲醇稀释至刻度，摇匀，作为系统适用性溶液。

2.2 色谱条件及系统适用性试验

采用YMC-Pack ODS A（4.6 mm×150 mm，5µm）色谱柱；以甲醇：水（99：1）为流动相，检测波长为228 nm，柱温35 ℃，流速1.4 ml/min，进样体积为20 μl。系统适用性溶液的HPLC图谱见图1。

图1 系统适用性溶液的液相色谱图

2.3 方法学验证

2.3.1 耐用性试验[10]取系统适用性溶液，通过改变色谱条件中色谱柱、流速、流动相比例、柱温等因素，考察耐用性。在微小变动因素条件下，主峰与三聚物之间分离度良好，结果表明，该色谱条件耐用性良好。结果见表1。

表1 耐用性试验结果表

2.3.2 检测限与定量限测定精密称取三聚物对照品适量，加甲醇溶解并用流动相定量稀释，制成不同梯度浓度的系列溶液，按2.2项色谱条件测定。测得鱼腥草素钠三聚物的检测限为2.45 ng（S/N≈3）；定量限为8.16 ng（S/N≈10）。

2.3.3 破坏性试验分别取鱼腥草素钠栓1粒，置入100 ml量瓶，加甲醇少许，将量瓶置热水浴中，轻轻振摇使完全溶解，分别加1 mol/L盐酸溶液1 ml，2 mol/L氢氧化钠溶液0.5 ml，90 ℃水浴加热1 h，冷却，分别以1 mol/L氢氧化钠溶液、2 mol/L盐酸溶液调节pH至中性，以甲醇稀释至刻度，摇匀，过滤，作为制剂酸、碱破坏储备液。取鱼腥草素钠栓1粒，置入100 ml量瓶，加甲醇少许，90 ℃水浴加热1 h，冷却，以甲醇稀释至刻度，摇匀，过滤，作为制剂高温破坏储备液。取鱼腥草素钠栓1粒，置入100 ml量瓶，加甲醇少许，加入30%双氧水溶液1 ml，置90 ℃水浴放置5 min，冷却，以甲醇稀释至刻度，摇匀，过滤，作为制剂氧化破坏储备液。精密移取各破坏储备液1 ml，置入10 ml量瓶，以甲醇稀释至刻度，摇匀，过滤，作为制剂破坏溶液。同法破坏空白基质栓，按2.1项同法制备破坏前供试品、破坏前空白基质栓溶液及三聚物对照品溶液，精密量取制剂破坏溶液、制剂破坏前供试品溶液、三聚物对照品溶液各20 µl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。按外标法计算三聚物含量，结果见表2。结果表明，制剂的高温、酸、碱、氧化破坏样品中各降解峰与主峰分离度良好，空白基质对三聚物无干扰，表明本色谱条件适用于鱼腥草素钠栓三聚物的检查。本方法具有专属性。

表2 破坏性试验结果表

2.3.4 线性与范围精密称取鱼腥草素钠三聚物约10 mg，置入100 ml量瓶，加甲醇少许，超声使其溶解，以甲醇稀释至刻度，摇匀。精密移取5 ml，置50 ml量瓶中，以甲醇稀释至刻度，摇匀，作为线性试验储备液。精密移取储备液1 ml置100 ml量瓶，以甲醇稀释至刻度，摇匀，再精密移取1 ml置入10 ml量瓶，以甲醇稀释至刻度，摇匀，作为线性试验溶液1，分别精密移取线性试验储备液1，2，4，5，6 ml置50 ml量瓶，以甲醇稀释至刻度，摇匀，作为线性溶液2，3，4，5，6。精密移取上述溶液各20 μl，注入高效液相色谱仪，记录色谱图。以浓度（X）对峰面积（Y）进行线性回归，得回归方程：Y=66 421X-309.41，相关系数r=0.9998。表明三聚物在0.009 43～1.131 μg/ml范围内浓度与峰面积呈良好的线性关系。

2.3.5 回收率试验取空白基质栓10粒，切成小片，精密称取适量（约相当于鱼腥草素钠栓一粒的重量），置入100 ml量瓶，加甲醇少许，将量瓶置热水浴中，轻轻振摇使其完全溶解，取出，放冷至室温，以甲醇稀释至刻度，摇匀。作为空白基质栓储备液。精密称取鱼腥草素钠三聚物2，5，10 mg各3份，分别置入100 ml量瓶，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。精密量取1 ml，分别置入10 ml量瓶，用甲醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液。精密量取空白基质栓储备液续滤液及对照品储备液1 ml，置入同一10 ml量瓶，用甲醇稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。按2.1.1项制备三聚物对照品溶液。

精密量取三聚物对照品溶液及各供试品溶液20 μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图及峰面积，按外标法计算，即得，结果见表3。

2.3.6 精密度试验精密量取三聚物对照品溶液20 μl注入液相色谱仪，连续进样6次，记录色谱图及峰面积。峰面积RSD为1.05%，表明仪器精密度良好。

2.3.7 重复性试验取供试品（批号120301），精密称定，按2.1.2项方法制备供试品溶液，平行配制6分，分别取20 μl注入液相色谱仪，考察方法的重复性，计算RSD为1.01%，表明方法重复性良好。

2.3.8 溶液稳定性试验精密量取三聚物对照品溶液20 μl，分别于0，2，4，6，8 h注入液相色谱仪。记录色谱图及峰面积，峰面积RSD为0.80%。表明溶液在8 h内稳定性良好。

3 三聚物的测定

取鱼腥草素钠栓三批（批号：120301，120302，120303），按2.1项供试品溶液及三聚物对照品溶液，精密量取供试品溶液、三聚物对照品溶液各20 µl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，供试品溶液色谱图中如有与三聚物对照品溶液色谱图中保留时间一致的峰，按外标法以峰面积计算，即得。结果分别是0.04%，0.04%，0.04%。

4 讨论

4.1 测定波长的选择

取鱼腥草素钠三聚物对照品适量，精密称定，加甲醇成每1 ml中含4.12 μg的溶液；取鱼腥草素钠栓2粒，精密称定，加甲醇制成每1 ml中含鱼腥草素钠0.01 mg溶液，以0.45 μm有机滤膜过滤，弃去初滤液，取续滤液备用；取空白基质适量，精密称定，同法配制。照分光光度法（中国药典2015年版四部附录0401）在200～400 nm波长范围内对以上各溶液进行扫描。结果表明，鱼腥草素钠三聚物对照品溶液以及鱼腥草素钠栓溶液均在228 nm处有最大吸收。空白基质无干扰，因此，选228 nm作为鱼腥草素钠三聚物检查的波长。