基于低场核磁共振技术的不同品牌黄明胶的快速鉴别初探

2019-04-12程素盼姜姣姣赵恒强郭兴峰张渝洁耿岩玲

食品与药品 2019年2期

程素盼，姜姣姣，赵恒强，郭兴峰，张渝洁，崔莉，王晓，耿岩玲*

（1.山东中医药大学药学院，山东济南 250355；2.齐鲁工业大学（山东省科学院），山东省分析测试中心，山东省中药质量控制技术重点实验室，山东济南 250014；3.聊城大学农学院，山东聊城 252059；4.临沂大学生命科学学院，山东临沂 276005）

黄明胶（cattle-hide glue）作为养血止血良药载于《部颁标准》，是牛科动物黄牛的皮经熬制并佐以黄酒、豆油等加工而成，性味甘平，主入肺、大肠经，具有滋阴润燥、养血止血的功效，临床上常用于治疗体虚便秘、肾虚遗精、吐血、呕血，胎漏、崩漏等症[1-4]。近年，随着消费者健康养生意识的逐步提高，胶类药材成为消费者日常滋补的选择之一，其中阿胶与黄明胶都是比较常见的滋补胶类药材，既可作为药品，又可作为普通食品[5-7]。目前市场上以阿胶为贵，阿胶的伪品较多且倍受重视，相较而言，黄明胶作为一味已上市的非处方药报道很少[1]，尚未实现不同品牌黄明胶的区分辨识[8]，亟需一种简便、快速、无损的鉴别不同品牌黄明胶的方法。

目前，胶类药材的鉴定技术主要有：液质联用检测多肽片段[8]，双向凝胶电泳[9]及DNA鉴定技术[10]。胶类药材被酶解后，经液质联用技术（HPLC-MS/MS）进行多肽识别，需要大量的测试、对比及后期验证工作，若在此基础上建立不同胶类药材酶解的特异性肽段及质谱信息库，对于实现胶类药材的专属性鉴别有重要价值，但如何找到一个可切割出尽量多特征肽段的蛋白酶难度较大。双向电泳与单独的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）或等电聚焦聚丙烯酰胺凝胶电泳（IEF-PAGE）相比，其分辨率更高，可直观地找出具有差异性的蛋白点，是目前较常见的蛋白质分离技术，但缺点是样品中盐、脂质等对此法影响严重且重现性较差。DNA鉴定法对于含其他种源性成分的胶类药材可进行准确判断，但成本高。因此开发一种快速、有效且操作简便的检测方法，是十分有意义的。

低场核磁共振（LF-NMR）是一种可靠的、信息丰富的非侵入性分析技术，可探寻天然产物中小分子的质子，因其快速、无损等优点广泛应用于对食品和药物的质量控制研究[11-18]。相比传统的胶类鉴定手段，LF-NMR技术具有诸多独特优势[19-20]：（1）过程简便，无需复杂的前处理；（2）安全性好；（3）检测速度快；（4）无损：无需加入试剂、不浪费样品，特别适合价格昂贵样品的真伪鉴别。本研究以不同厂家黄明胶为研究对象，结合主成分法（PCA）对所获得的CPMG（Carr-Purcell-Meiboom-Gill）脉冲序列回波峰点数据进行分析处理，为探索LF-NMR鉴别不同品牌黄明胶提供试验依据。

1 仪器与材料

NMI20-Analyst核磁共振分析仪（上海纽迈）；飞利浦料理机HR2874/00（飞利浦电子公司）；ME20型电子分析天平（瑞士梅特勒-托利多）。5个不同厂家黄明胶样品具体信息见表1。

表1 黄明胶样品来源

2 方法

2.1 样品制备

将表1中5个不同品牌黄明胶样品分别经料理机粉碎后，过40目筛，备用。

2.2 样品检测

取样品粉末10 g，置入20 mm核磁管底部，于35 ℃下使用LF-NMR在CPMG脉冲序列下采集信号，设置参数如表1，每类样品设置8个平行样品，每个样品重复测定3次，求取平均值。

表2 应用脉冲序列参数

2.3 数据处理与分析

采用Multi Exp Inv Analysis软件对不同品牌黄明胶样品CPMG回波峰点数据进行反演拟合，并使用SPSS 22.0软件对反演后的T2弛豫时间、峰面积S2及峰面积所占比例P进行主成分分析（PCA），采用Origin 8.5对结果进行绘图。

3 结果与分析

3.1 不同品牌黄明胶的T2反演图谱

图1显示了5个不同品牌黄明胶的横向弛豫时间图谱，由图1可见，5个不同品牌的黄明胶均包含3个峰：T21、T22和T23。5个品牌黄明胶进行两两比较，弛豫时间T2和峰面积S2均明显不同。LF-NMR结果见表3。由表3可见，任取2个不同品牌的黄明胶进行对比，6个变量中至少有4个变量差异有统计学意义。

表3 不同品牌黄明胶LF-NMR结果

图1 不同品牌黄明胶的横向弛豫图谱

3.2 不同品牌黄明胶的PCA结果

主成分分析（principal component analysis，PCA）是模式识别中较常用的多元数据统计分析方法[21]。在不丢掉原来主要信息的前提下，从多个数值变量（指标）之间的相互关系入手，利用降维的思想，将原来的多个指标组合成少数几个互不相干的综合指标，形成特征向量。利用降维后的特征向量作PCA散点图，使数据可视化，进而直观地反映样品之间的整体差异。

选取反演后得到5个品牌黄明胶样品信息的9个变量（T21、T22、T23峰起始时间、峰面积S21、S22、S23及相应峰面积所占比例P）进行PCA，根据PCA原理，主成分1为图2中横坐标，主成分2为纵坐标，其中包含了各主成分在PCA转换中的贡献率。总贡献率大于70%～85%的方法即可使用[22-24]，贡献率越大，说明主成分可较好地反映原始变量信息。图2为5个品牌黄明胶前两个主成分PC1和PC2的得分图，图中每个样品的整体特性用一个圈表征，其中8个小点代表此样品的平行样品。不同样品类间品质差异与样品间隔距离成正比，距离越远样品品质差异越大[25]。

图2 不同品牌黄明胶的PCA得分图

根据表3不同品牌黄明胶之间差异性比较，将反演后得到的9个变量（T21、T22、T23峰起始时间、峰面积S21、S22、S23及相应峰面积所占比例P）均进行PCA。PC1和PC2得分累积贡献率为97.38%，其中PC1的贡献率为91.73%，即保留了91.73%的原始数据信息，PC2包含了5.65%的信息。由图2可见，5种不同品牌的黄明胶分布距离较远，虽在PC1轴上得不到准确区分，但结合PC2轴后，均能两两区分开来，推测是由于不同品牌黄明胶生产工艺、生产用水、所用辅料等存在一定的差异[25]，导致LF-NMR结果存在明显差异，在PCA得分图上被很好地体现出来。