谷子籽粒小米黄色素含量的测定

2019-04-12杨延兵王润丰邓立刚陈二影管延安

中国粮油学报 2019年3期

杨延兵张涵王润丰邓立刚秦岭陈二影管延安

(山东省农业科学院作物研究所1，济南 250100) (山东省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所2，济南 250100)

谷子[Setariaitalica(L.) P. Beauv.]又称为粟，去壳后称为小米，在植物学上属禾本科狗尾草属。它起源于中国，栽培历史悠久，据考古学研究，距今约有一万多年的栽培历史[1-2]，曾长期是我国北方的主要粮食作物。它抗旱耐瘠、水分利用效率高、适应性广，至今在干旱和半干旱地区仍是重要的粮食作物。小米营养丰富且各种成分平衡，其品质在营养保健中的作用独特，加强研究、发掘利用这一作物的营养保健价值，对于促进农业供给侧结构性改革，丰富提高人们日益增长的物质生活需求有重要意义。

多数谷子品种的小米为黄色，黄色的主要来源为黄色素。小米黄色素主要组分为天然类胡萝卜素，主要含有叶黄素、玉米黄质以及少量的隐黄质、β-胡萝卜素等[3-5]，这些类胡萝类素不仅具有保护视觉与上皮细胞的作用，而且可以提高人体免疫力，淬灭体内过多自由基，预防多种癌症，同时对口腔溃疡、皮肤病等都有很好的疗效。不同谷子品种的小米黄色素及主要组分类胡萝卜素含量存在差异，研究培育类胡萝卜含量高，色泽金黄，外观品质好的谷子新品种是谷子遗传育种的重要目标之一，因此定量测定谷子品种小米黄色素含量对于选育高类胡萝卜素含量的品种有重要的意义。同时，定量测定小米黄色素含量有助于小米产品质量评判的标准化，促进小米产品的精深加工。

小米黄色素具有一定的耐热性、耐还原性和耐氧化性,对光和酸性条件稳定性较差，不溶于水，易溶于乙醇、乙酸乙酯、丙酮、甲醇等有机溶剂,其乙醇提取物最大吸收波长为445 nm或446 nm[6-8]；利用超声波辅助提取可以明显增加小米黄色素产量[9-10]。这些研究主要侧重于对小米黄色素化学性质及其提高小米黄色素得率，研究探讨利用提取的小米黄色素作为色素添加剂应用食品工业等方面，而关于小米黄色素的定量测定研究则较少。杨延兵等[12-13]参考美国谷物化学师协会AACC 14-50[11]测定小麦粉黄色素的方法研究了我国谷子品种小米黄色素含量的差异及小米黄色素与外观品质的关系,研究表明小米黄色素含量的高低不仅和小米的营养价值有关，而且也是反映小米外观品质的重要指标。然而，小米黄色素组成和小麦粉黄色素组成可能存在一定的差异。因此，优化完善谷子品种中小米黄色素的测定，比较准确地测定小米黄色素含量，尽可能减少误差，具有重要的意义。

本研究从不同溶剂、提取时间、提取方式和回收率等方面对小米黄色素的测定进行了研究，以期为小米黄色素的定量测定以及谷子品质育种提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

谷子品种：济谷12、济谷16、济谷17、济谷19、豫谷18。

标准品及试剂：叶黄素、玉米黄素、β-胡萝卜素标样： Chromadex 公司；β-隐黄质：Sigma公司(美国)；三氯甲烷、无水乙醇、正丁醇等试剂：国药集团。

1.2 仪器设备

RETSCH粉碎机；SORVALL台式多用离心机-冷冻型；UV2600紫外/可见光分光光度计。

1.3 方法

1.3.1 不同提取因素对小米黄色素的提取实验

不同溶剂提取小米黄色素：选用无水乙醇、水饱和正丁醇3种不同溶剂进行提取。

不同提取方式提取小米黄色素：无水乙醇、水饱和正丁醇2种提取液振荡提取(1、2、3 h)和振荡提取(1、2、3 h)+超声波提取20 min。

利用水饱和正丁醇提取不同时间的小米黄色素：1、3、5、7、24 h。

1.3.2 建立标准曲线

1.3.3 样品处理测定

用砻谷机把谷子籽粒脱壳，把小米超离心粉碎。称取1.00 g样品放入约30 mL具塞的离心管内，加入10.0 mL水饱和正丁醇，盖紧塞子，混旋器上混合，使样品充分湿润。把离心管放在往复振荡机上避光振荡提取一定时间，然后静置10 min。10 000×g离心8 min至上清液清亮，以水饱和正丁醇空白作对照，吸收波长 445 nm处测定提取液吸光度，计算黄色素含量。

小米黄色素含量=ε·A，ε为根据标准曲线得到的系数，A为提取液吸光度。

2 结果与分析

2.1 提取溶剂对小米黄色素的影响

利用无水乙醇和水饱和正丁醇提取不同谷子品种小米黄色素，进行光谱扫描，记录最大峰值。无水乙醇和水饱和正丁醇提取同一品种小米黄色素扫描光谱有一定差异(图1为济谷19小米2种提取液扫描光谱)。2种溶剂提取的小米黄色素最大吸收峰值也略有差异(表1)，不同品种无水乙醇提取液最大波峰值平均为445.8 nm，水饱和正丁醇提取液最大波峰值平均为447.5 nm。说明2种提取液提取的小米黄色素在质和量上有一定差异。同一提取液不同品种之间最大吸收波长也略有差异，这说明不同品种之间在黄色素的组分上存在差异。

图1 不同提取溶剂提取济谷19小米黄色素吸收光谱图

品种无水乙醇提取液/nm水饱和正丁醇提取液/nm济谷12446.0447.6济谷16446.0447.4济谷17445.4447.4济谷19446.0447.6豫谷18445.4447.3平均445.8447.5

图2 小米黄色素及部分类胡萝卜标准物质光谱图

2.2 小米黄色素与主要组分标准物质光谱比较

对小米黄色素提取物及叶黄素、玉米黄质、β-隐黄质、β-胡萝卜素等标准物质在350～550 nm范围内进行光谱扫描(图2)。不同类胡萝卜素之间光谱特征有一定差异，小米黄色素的光谱特征和叶黄素光谱特征最接近。叶黄素最大峰值445 nm，玉米黄质最大峰值452 nm，β-隐黄质最大峰值451 nm，β-胡萝卜素最大峰值450 nm，小米黄色素最大峰值447.5 nm。

2.3 提取溶剂对小米黄色素含量提取效率的影响

分别利用水饱和正丁醇和无水乙醇往复震荡提取3 h进行提取完全度实验，测定5个谷子品种小米黄色素含量，结果如表2。每个品种无水乙醇提取液小米黄色素测定值都低于水饱和正丁醇提取小米黄色素测定值，乙醇提取小米黄色素测定值只有水饱和正丁醇提取测定值的66.93%～73.76%，平均为69.78%，利用水饱和正丁醇提取的小米黄色素较完全。

表2 不同提取溶剂对小米黄色素含量的影响

2.4 提取方式对小米黄色素含量的影响

以济谷16小米样品为试材，分别利用水饱和正丁醇和无水乙醇采用振荡提取和振荡提取+超声波20 min 2种方式，提取不同时间(1、3、5 h)，测定小米黄色素含量，结果表3。同一提取时间，水饱和正丁醇提取黄色素含量显著大于乙醇提取黄色素含量。2种溶剂同一时间振荡提取后，再用超声波提取20 min，黄色素含量平均值明显增大，但标准偏差也相应增大，测定黄色素含量的稳定性变差。

表3 不同提取方式小米黄色素含量的影响/mg/kg

2.5 提取时间对小米黄色素含量的影响

利用水饱和正丁醇提取小米黄色素1、2、3、5、7、24 h，测定结果如表4。提取1 h黄色素含量略低，3～7 h小米黄色素含量基本维持在平台期，黄色素含量的变化很小。因此，小米黄色素振荡提取3 h后测定，在2～4 h时间内测定完毕，小米黄色素含量变化相对较小。振荡提取24 h后小米黄色素含量有略微下降，这可能与提取时间过长，部分小米黄色素降解所致。所以测定小米黄色素含量以先振荡提取3 h，再开始测定为宜。

表4 提取时间对小米黄色素含量的影响/mg/kg

2.6 标准曲线的建立

绘制的β-胡萝卜素标准曲线如图3，线性范围0～5.0 μg/mL，标准曲线回归方程：小米黄色素含量=54.7·A，相关系数r=0.999 9。

图3 标准曲线

2.7 不同谷子品种黄色素样品测定与回收率分析

精确称取1.0 g不同谷子品种小米样品，每个样品重复5次，按照1.3.5制备的样品溶液，振荡提取3 h，测定小米黄色素含量，计算相对标准偏差(RSD)。同时，每个样品再称取5份，添加β-胡萝卜素标准溶液，计算加标回收率，结果如表5。结果5个谷子品种相对标准偏差RSD 1.16%～2.14%，都小于3%，表明该方法准确可靠，精密度较高。各样品加标回收率为92.77%～103.18%，表明该方法测定结果准确。

表5 样品测定结果及加标回收率测定结果(n=5)

3 讨论

本研究分别利用无水乙醇和水饱和正丁醇提取小米黄色素，利用水饱和正丁醇提取小米黄色素较完全，得率较高。利用水饱和正丁醇提取小米黄色素，经过高速离心后一般提取上清液透明，测定值较稳定，比较适于对小米黄色素含量做定量测定。但正丁醇会易散发出令人难闻的气味，测定最好在通风橱内完成。用无水乙醇提取，小米黄色素得率低于水饱和正丁醇提取；而且离心后，部分品种提取液易出现一定的浑浊，测定值不太稳定，不太适用于大量样品谷子黄色素的定量测定；但由于无水酒精提取液酒精易挥发，酒精挥发后得到黄色素固体粉末，且酒精无毒，适于食用色素的提取。

有关研究表明，利用超声波提取，可以提高小米黄色素产量[9-10]，本研究表明超声波的确能增加黄色素产量。但是，在实验过程中，超声波提取后实验数据稳定性变差，有的提取液中有细微小颗粒，疑似提取液浑浊。造成这种现象的原因可能是超声提取状态下，产生细微的固体或液体颗粒，而这种小颗粒难以通过加大离心转速解决，造成实验结果误差较大；因此定量测定小米黄色素，提取过程不宜使用超声波处理，直接振荡提取就可。

本实验研究了不同提取时间、提取方式对小米黄色素含量的影响，提取时期短提取不充分，研究条件下认为振荡提取3 h是比较适宜的时间；3～5 h时间内避光振荡提取对小米黄色素变化较小，这为大批量测定实验样品提供了参考。

本研究分别利用无水乙醇和水饱和正丁醇提取小米黄色素，无水乙醇提取液最大吸收波长平均445.8 nm，水饱和正丁醇最大吸收波长平均447.5 nm，与其他研究结果类似[7-8,15]。叶黄素为小米中黄色素最主要组分，本研究中小米叶黄素最大吸收峰波长为445.8 nm，这和报道的叶黄素波长基本相同[16]，细微的波长差异可能在于物质的纯度及测定误差。AACC 14-50测定小麦的黄色素含量测定波长为435.8 nm，其主要根据混合物中主要组分叶黄素设定测定的吸收波长[16]，本研究中小米黄色素的吸收光谱和叶黄素吸收光谱最相似，叶黄素的最大吸收波长为445 nm, 所以本研究中黄色素含量都在445 nm下测定。研究利用β-胡萝卜素制作标准曲线，而小米黄色素主要成分为叶黄素和玉米黄质，β-胡萝卜素含量较少[5]，小米黄色素为多种胡萝卜素或类胡萝卜素的混合物，所以测定的小米黄色素含量不是绝对含量，而是同一测定系统下的相对值。